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本文作者：刘传银 胡继明 单位：襄樊学院化学工程与食品科学学院 生物医学分析化学教育部重点实验室
生物传感器是由生物活性单元(如酶、抗体、蛋白质、核酸和细胞等)和信号转换器组成并利用生物识别原理来进行检测的一种装置［1］。它是一种由生物、化学、物理、医学和电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、在复杂的体系中进行在线连续监测，及其易于自动化、微型化与集成化的特点。特别是近年来分子生物学、微电子学、光电子学、微细加工技术及纳米技术等新学科和新技术的进展，使生物传感器的研究蓬勃发展，成为新兴的高技术产业的重要组成部分。根据分子识别元件与待测物结合的性质可将生物传感器分为生物催化型(代谢型)和生物亲和型(受体型)。生物亲和型传感器是利用分子间特异的亲和性，即生物活性物质对底物的亲和或键合作用而建立起来的，如免疫传感器、受体传感器和DNA传感器等。根据生物反应产生信息的物理或化学性质，可采用电化学、光谱、热、压电和表面声波等技术进行检测［1］。本文按照传感信号方式的不同，对近年来亲和型生物传感器在生物医学上的进展予以综述。
1免疫传感器
癌症是人类健康的杀手，是否能较早诊断出癌症的前期征兆是影响癌症患者恢复的关键因素。众所周知，在肿瘤发展的过程中，肿瘤组织或细胞会释放出一些特异性的蛋白质进入循环体系，而这些特异性蛋白在血液中的含量水平标志着肿瘤发展的阶段，所以在生物医学上常将这些特异性蛋白称为肿瘤标记物。临床医学上常将这些肿瘤标记物的检测作为临床检验和诊断的重要依据［1］。生物化学、酶联免疫和分子生物学等多种方法已用于肿瘤标记物的检测，虽然这些方法具有较高的选择性、准确度，但是存在辐射威胁、耗时和费用较高等缺点。由于免疫传感器结合了免疫反应的特异性分子识别和便利的检测技术而得到研究者的普遍关注，故开发快速而准确的肿瘤标记物的免疫传感器成为生物医学检测的研究热点。肿瘤标记物一般分为以下几类:酶、糖蛋白、粘糖蛋白、激素、免疫分子和癌基因等。临床医学实践表明，甲胎蛋白(AFP)、降血钙素(CT)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺素(hCG)、前列腺特异抗原(PSA)、鳞状上皮细胞抗原(SCCA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)和CA(CarcinomaAntigen)等均是典型的肿瘤标记物［1］。如肠癌的肿瘤标记物为CEA、CA19-9和CA24-2;前列腺癌的肿瘤标记物为F-PSA、PSA和PAP。按照免疫传感器检测信号的不同，可分为电化学型、光学型和质量敏感型等。
1．1电化学免疫传感器
电化学免疫传感器可再分为电位型、电容型和电流型。电位型传感器在免疫传感中应用不多。梁茹萍等［2］利用戊二醛交联CA15-3抗体的电位型免疫传感器用于乳腺癌CA15-3的检测，获得了良好的检出限(5U/mL)和稳定性(30d)。Fu等［3］制备了40nm的氧化铁纳米柱修饰碳糊电极，用于固定CEA建立了测定CEA的电位型免疫传感器。其线性范围为1.5～80μg/L，检出限为0.9μg/L。对临床血液样本的检测结果与酶联免疫法相符合。Zhou等［4］将纳米金吸附在溶于PVC的邻苯二胺的氨基上，制备了一种增塑的PVC膜的电位传感器用于α-AFP的检测。该传感器的响应时间短(4min)、检出限低(1.6μg/L)。但电位型免疫传感器的不足之处在于:信噪比较低，线性范围窄，非特异性抗体-抗原作用及背景信号较高。电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技术。在电容型免疫传感器的制作中，传感界面的构建和生物识别层的固定是影响其性能的重要因素。可采用半导体氧化物膜、自组装单分子膜、电聚合膜、溶胶凝胶膜和等离子体聚合膜等来构建电容型免疫传感器。Fernandez-Sanchez等［5］研制了可以用于检测PSA的免疫传感器。他们将对pH敏感的聚合物附着在电化学传感器的表面，用于快速而灵敏地检测亲和反应过程中的电容及阻抗变化，实现了对PSA的灵敏检测。Quershi等［6］在纳米晶钻(NCD)-interdigitatedgold(GID)电极表面固载抗体，进而通过电容法测定心血管标记物CRP。结果表明，电容器的灵敏度表现在两个方面，一是当抗体与抗原结合后，极化常数和弛豫时间常数明显增大，二是传感器的灵敏度与抗体浓度及施加频率紧密相关。袁若等［7］报道了一种在玻碳电极表面修饰金纳米粒子，进而吸附CEA抗体，用铁探针离子的阻抗特性来检测CEA，获得了良好的检出限和灵敏度。
Rajesh等［8］在ITO修饰电极上利用自组装膜固定α-CRP，利用电化学阻抗法检测α-CRP抗体与抗原的亲和作用，其检出限达到3.5μg/L。由于电容法和阻抗法可以获取直接、非标记的亲和信号，所以在临床诊断上具有良好的发展前景。但电容法存在的问题在于响应电容易受到非特异性吸附的影响，其重现性不如法拉第阻抗法与伏安法。所以如何优化传感界面，改善响应电容的重现性和稳定性仍是电容型免疫传感器发展中的关键问题。电流型免疫传感器备受研究者的关注。由于大多数待测物不能直接参与电化学反应，常采用加入电子媒介体和标记酶来催化底物转化为电活性物质来制备传感器。虽然加入电子媒介体会降低检出限，但其分离和洗涤步骤限制了它在生物医学上的广泛应用。而基于标记酶的直接电子传递的免疫传感器则简化了分离和洗涤步骤，在生物医学上的应用更有吸引力。鞠幌先研究组曾对肿瘤标记物的电流型传感器进行了深入的研究［9-12］。如将硫堇和HRP标记的CEA抗体通过戊二醛交联在电极表面，制成了一种具有良好稳定性的传感器。该传感器减少了加入电子媒介体的麻烦，并且不需乳化和洗涤，线性范围为0.5～3.0和3.0～167μg/L，检出限为0.1μg/L，重现性良好［10］。他们还研究了基于HRP的直接电子传递的免疫CEA传感器，对CEA的检出限为0.3μg/L，并将实际样品的检测结果与临床检测方法相比照，获得了满意的结果［12］。除此之外，研究人员还结合纳米粒子的电子传导、丝网印刷技术、微流控装置、毛细管电泳和流动注射等技术对肿瘤标记物的检测进行了研究。
Jin等［13］结合毛细管电泳和电化学检测技术，对肿瘤标记物CA125进行了检测。Kojima等［14］设计了一种包含36个Pt微电极的阵列，运用不同的抗体来捕获肿瘤标记抗原，采用电化学免疫检测技术实现了多标记物的同时检测。Wilson等［15］采用双电极的免疫传感器同时采用安培法测定了CEA和AFP，获得了1μg/L的低检出限，并有效抑制了交叉干扰。研究表明，这些新技术在免疫传感器中的引入，不仅降低了待测物的检出限，而且可以有效降低共存物质的干扰，并可实现多通道同时检测多种肿瘤标记物。由于纳米材料的独特性质，使其在实时、灵敏检测标记物方面具有广泛的应用前景。如Zheng等［16］利用抗体功能化的二氧化硅纳米线制备了一种新型传感器，用于在血浆中的癌症标记物的非标记实时监测。Ramanathan等［17］和Willner等［18］曾报道利用聚合物纳米线和碳纳米管进行相关生物亲和体系内标记物的检测。Wu等［19］将CEA/纳米金通过壳聚糖固定在丝网印刷电极上，结合流动注射法建立了一种快速而方便的CEA电化学免疫传感器，CEA检测的线性范围为0.50～25μg/L，检出限为0.22μg/L。该传感器通过流动注射HRP-anti-CEA，故可以控制乳化时间，并易于自动化。Wang等［20］将聚鸟嘌呤功能化的二氧化硅纳米粒子标记坏疽抗体的夹心型传感器用于坏疽因子的电化学测定，可直接用于生物样品中坏疽因子的检测，检出限为2.0pmol/L。Chen等［21］在玻碳电极表面气相沉积纳米金/硅溶胶，将HRP功能化的hCG抗体固定于其上，建立了一种无试剂的电化学免疫传感器用于hCG的灵敏检测，其检出限为0.3mIU/mL。Wang等［1］对近年来功能化碳纳米管在肿瘤标记物上的应用进行了综述。#p#分页标题#e#
1．2光学免疫传感器
由于光学免疫传感器具有非破坏性操作、快速获取信号及使用可见光辐射等优势，故在肿瘤标记物的检测中占有重要地位。根据其检测原理，光学免疫传感器可分为荧光、化学发光和表面等离子体共振等类型。近年来，荧光检测在临床诊断和检测中获得了很大的进展。Nakamura等［35］结合流动注射系统和阳离子交换树脂毛细管柱制备了hCG免疫传感器。利用离子交换柱来分离FITC-IgG和FITC-IgG抗体，然后利用荧光检测hCG，其线性范围为25～1500mIU/mL。Yan等［36］将免疫亲和反应柱与流动注射体系相连接，然后通过时间分辨荧光免疫检测法进行CEA的测定(如图1所示)。纳米材料特别是量子点的引入，使荧光型生物传感器的发展尤为引人瞩目，Zhong［37］对近年来基于荧光生物传感中纳米材料的应用进行了综述。Hong等［38］对纳米金、溶剂对荧光团的荧光效应进行了比较研究，发现纳米金试剂的荧光增强效应可以使肿瘤标记物的检出限降低10倍，并且对心血管标记物CRP的检出限可低至数10pmol。化学发光免疫传感器多采用直接化学发光、化学发光基底标记和酶标记等3种技术。但大多数化学发光免疫传感器是利用酶增大检测信号，并与流动注射系统相结合来提高其检测自动化性能。Ju等［39］对化学发光免疫传感器的自动化进行了较多研究，并对近年来电化学发光传感器在肿瘤标记物方面的应用进行了综述。
Jie等［40］首次以gold/silica/CdSe-CdS杂交纳米结构制备了灵敏的电化学发光生物传感器，用于测定CEA，获得了良好的效果。虽然化学发光免疫传感器的灵敏度高，选择性好，但是改善肿瘤标记物的固定化技术和传感器的微型化、集成化仍是化学发光免疫传感器的发展方向。表面等离子体共振(SPR)是利用金属膜/液面界面光的全反射来分析生物分子相互作用的一项新兴技术，生物传感芯片是SPR传感器的核心部分。它对免疫特异识别、蛋白质折叠机理、生物特异相互作用的结合位点及浓度分析上具有独特的优势，并且可以获得很低的检出限(10－13～10－9mol/L)。可实时监测生物大分子之间的相互作用及其影响因素的作用环节，成为疾病诊断和机理研究的有效工具。Chou等［41］将抗人铁蛋白单克隆抗体固定在SPR敏感的金表面，建立了人铁蛋白的SPR免疫传感器，可以测定非特异性肿瘤标记物人铁蛋白。Yu等［42］基于表面等离子体的衍射建立了hCG的免疫传感器。Corso等［43］将抗体通过自组装膜固定在金表面，建立了一种实时灵敏监测胰腺癌的肿瘤标记物间皮蛋白的声波免疫传感器，可以检测纳克级的间皮蛋白(mesothelin)。近年来，诸多研究集中在如何克服SPR传感器检测小分子灵敏度低的问题，相信随着SPR传感器在肿瘤标记物研究上的深入，其在生物医学领域的应用将更为广泛。
1．3质量型免疫传感器
石英晶体微天平(QCM)型免疫传感器由于其非标记和实时监测的特点使其在肿瘤标记物的检测中也有较多应用。Zhang等［44］制备了一种2×5模式的多通道压电QCM用于检测血液和尿液中的hCG，其检测效率高，比单通道检测的速度快8倍以上。Kim等［45］在微芯片上制备了检测心血管标记物CRP的QCM免疫传感器，对CRP的检测线性范围宽，达到0.13～25016μg/L，检出限为0.13μg/L。
1．4免疫传感器在多分析物同时检测中的应用
在医学临床诊断中，某一种非特异性肿瘤标记物的值升高并不能确诊癌症，常需要进行多个肿瘤标记物的同时检测，才能获得准确的诊断结果［1］。Matsumoto等［46］报道了一种利用时间分辨荧光免疫传感器同时测定α-AFP和CEA，他们采用Eu标记的抗AFP抗体及Sm-标记的亲和素来测定α-AFP和CEA，获得了较低的检出限，它们的检出限分别为0.07和0.3μg/L，并在实际样品的测定中获得了良好的准确度。Song等［47］用微分析系统荧光免疫传感器同时测定了CEA、AFP、β-HCG、CA125、CA19-9和CA15-3，均获得了较宽的线性范围，对于CEA、AFP、β-HCG为0～640μg/L，对于CA125、CA19-9和CA15-3为0～1280μg/L。Kojima等［14］将捕获抗体固定在双层硅氧烷层中，制备了微蛋白质芯片用于AFP和β2-微球蛋白的电化学免疫检测，由于采用了夹心型的结构，有效降低了酶催化产物的扩散而获得较高的灵敏度。Wu等［48］用醋酸纤维素共固定硫堇和2种抗原于丝网印刷芯片的碳电极上，用于CA19-9和CA125的电化学免疫测定，其检出限分别为0.2和0.4U/mL。Fu等［49］采用双通道体系化学发光免疫同时检测α-AFP和CEA，对α-AFP和CEA的检出限分别达到1.5和0.25μg/L。Wilson等［50-52］将微芯片技术与电化学免疫结合，分别进行了CEA、AFP，4种不同的蛋白质及7种肿瘤标记物的同时检测。他们采用多个IrOx传感器来降低酶催化产物的扩散，进而在电极上获得良好的电化学响应，并获得了较低的检出限。Qureshi等［53］利用GID电极电容法同时检测抗CRP、α-TNF和IL6，其检测范围为25pg/mL～25ng/mL，为心血管患者提供了良好的前期诊断。能同时检测多个肿瘤标记物的免疫传感器及微流控芯片系统的应用，在癌症的预期诊断方面是现今重点发展的方向。
2适体生物传感器
核酸适体是一种能够与蛋白质、小分子、离子、核酸、甚至整个细胞等目标分子结合，通过指数富集的配位系统进化技术(SELEX)经体外筛选的人工合成寡聚核苷酸或肽分子。适配体还具有分子量小、易体外合成和修饰、化学稳定性好等优点，常被称为“化学抗体”，故一经出现便成为化学工作者用于分子识别和靶标物检测研究的得力工具，为生物分析方法和传感器的设计开辟了新的思路［54］。核酸适体可形成一些稳定的三维空间结构，如发夹、假结、凸环和G-四链体等结构。分子识别时，在目标分析物诱导下单链核酸适体会折叠成特殊的二级结构。常见的适体与靶体之间的作用有单位点结合和双位点结合(夹心型)2种。研究表明，适配体的结构稍有差异，则靶分子与其结合就受到阻碍［54］。显然，适体的这些特点对于发展高灵敏、高选择性和快速高通量的靶标分子分析检测十分重要，并日渐成为分析化学领域的研究和应用热点。研究人员已经成功地创建了大量基于核酸适体的分析新方法，包括电化学法、荧光、比色法、压电和SPR等［55-57］。
2．1电化学适体传感器
电化学适体传感器集合了核酸适体和电化学传感器的优势，成为近年来的一个研究热点。在阻抗型电化学适体传感器中，适体的固定化程序至关重要。通常有混合自组装膜和在自组装膜上共价固定等几种方法。Wang等［58］首次报道了识别诱导表面电荷转换的FIS适体传感器。结果表明，如果体系pH低于目标蛋白pI，则蛋白质的识别将扭转表面电荷状态，促进电子转移，因而会降低电荷转移阻抗。Liao等［59］将适体固定在硅电极表面，用于检测神经炎细胞因子PDGF，建立了一种无试剂的阻抗生物传感器，其检出限达到40nmol/L。Kwon等［60］以抗血管内皮生长因子(VEGF)适体与羧基聚吡咯纳米管构建了场效应晶体管用以测定VEGF，其检出限为400fmol/L，可用于实时检测VEGF。当核酸适体与特定的蛋白质结合时，有典型的构型变换，而抗体则没有这样的性质，利用这个性质可以设计构型变换型适体传感器。通常，将适体信标的一端修饰官能团用于电极表面的固定化，另一端修饰电活性标记物来产生电信号。电信号的大小是由活性标记物与电极表面之间的距离决定的。Xiao等［61］将亚甲蓝标记的抗凝血酶适体固定在电极表面，制备了一种基于电化学开关效应测定凝血酶的生物传感器(如图3A所示)，但该种传感器在靶分子与适体结合后信号减小。为了克服这个问题，Radi等［62-63］设计了另一种开关装置用于凝血酶的测定(图3B)。由于四链体的形成，二茂铁与电极之间的距离大大减小而显示出电化学信号。#p#分页标题#e#
由于适体的刚性较差，所以存在较大的背景信号，降低了信噪比和检出限。Zuo等［64］将二茂铁功能化的抗ATP适体固定在电极表面，在ATP存在下，互补序列解离而与ATP结合成三维的刚性结构，进而二茂铁与电极表面发生电子传递，显示出开关的作用，ATP的检测范围较宽(10nmol/L～1mmol/L)并具有高的灵敏度(图3C)。Fan等［65］将3'-端连有羧基二茂铁的发卡式结构DNA探针通过5'-巯基固定在金电极上，根据标记物杂交前后与电极表面距离的变化进行电化学检测，对目标DNA的检出限达到1.0×10－11mol/L。他们将该方法应用于PCR扩增产物的研究，该方法具有PCR扩增产物无需后续纯化、快速检测的优点。Chu等［66］提出了基于免疫-RCA的适体电化学传感器用于PDGF-BB的超灵敏检测。在电极表面形成抗体-PDGF-BB-适体-引物复合体这样的三明治结构后，引入一种与引物结合的“C”型挂锁探针。该方法结合了滚环扩增和酶催化两步放大，实现了PDGF的超灵敏检测，下限可达10fmol/L。Huang等［67］采用类似原理将PDGF-BB采用抗体和适体-引物捕获到电极表面，通过嵌入MB产生电化学响应，其检测限为18pg/mL。这种基于靶分子的结合而引起构型变换的电化学传感器，提供了一种无试剂、再生和灵敏的方法用于复杂样品中目标分析物的检测。一些平面分子如亚甲蓝、Ru(NH3)3+6、功能化二茂铁等也可以插入双链DNA中并经DNA碱基对π堆积实现电子转移而被氧化，进而利用特异性序列与蛋白质的作用进行电化学检测。Jin等［68］利用5'-SH的发卡式结构探针固定于金电极表面，用亚甲基兰为杂交指示剂检测P53基因，并对不同位置的单碱基错配序列进行了研究。该方法无需对发卡式DNA探针进行标记，实验证明发卡式DNA探针有很高的杂交特异性，可以识别单碱基错配序列，并且错配碱基位于环中央时对杂交效率影响最大。
Zhang等［69］在金电极阵列上分别自组装巯基发卡式DNA探针，采用亚甲蓝为杂交指示剂，方波伏安法检测了人体免疫缺陷蛋白HIV-1和HIV-2，对二者的检出限均达到了0.1nmol/L。Mir等［70］对凝血酶的不同适体生物传感器的制备方式对测定结果的影响进行了详细的比较研究。适体在与靶标分子特异性结合后，其三级结构将发生改变，随之发生变化的有适体的电荷密度、吸附性质和空间位阻等一系列因素。采用纳米材料不仅可以将上述这些变化因素转化为可检测的光学、电化学信号，而且还可以提高分析检测的灵敏度。Numunuam等［71］首次以CdS量子点标记二级适体，建立了夹心型电位法测定蛋白质的电位传感器，凝血酶的检出限为0.14nmol/L。Hansen等［72］利用CdS量子点修饰适体建立了7种不同蛋白质的同时电化学检测，其检出限为0.5pmol/L，而且具有良好的选择性。该方法为超痕量的生物标记物的检测及肿瘤的早期诊断提供了可能。Polsky等［73］利用Pt纳米粒子功能化的适配体进行了凝血酶的电化学检测。由于纳米粒子对过氧化氢的催化还原，放大了电信号而使凝血酶的检测限降低到纳摩尔的水平。He等［74］将含有聚腺嘌呤序列的抗凝血酶适配体对纳米金予以功能化，然后基于凝血酶与抗体的特异性作用固定在电极表面，然后腺嘌呤核糖酶降解释放而直接在热解石墨电极上检测。由于纳米粒子可以载带较多的适配体，所以检测灵敏度可以降低至0.1μg/L。Li等［75］在金电极上预先修饰2种分别含有腺苷酸和凝血酶的适体，捕获探针预先用纳米金及硫化物纳米粒子固定的DNA链杂交，构成了一种夹心型的传感器用于腺苷酸和凝血酶的阳极溶出伏安测定，其检出限分别为6.6×10－12和1.0×10－12mol/L。Velasco-Garcia等［76］和Hianik等［77］对适体电化学生物传感器的研究进展进行了评述，并对其发展前景进行了展望。总的来说，虽然报道的多种构建电化学适体传感器的方法获得了较为满意的分析性能，但对电化学适体传感器的分析性能和各项参数的研究和评价还不充分，在实际体系中的应用也还需要拓展。
2．2光学适体传感器
随着能与蛋白质等生物大分子特异结合的适体的筛选和发现，基于纳米材料的比色技术日渐成为生物大分子识别和检测的有力工具。由于适体-纳米粒子的比色检测灵敏度高、操作简单，因而对蛋白质分析和癌症的诊断具有重要意义。图4为比色法测定蛋白质的基本原理。Mao等［78］利用分子信标的特异性识别特性和金纳米粒子的光学特性，建立了快速、灵敏而价廉的检测DNA的方法。Liu等［79］报道了一种纳米粒子-适体的生物传感器可直接用于血液中癌细胞拉莫斯细胞的比色法检测，为循环系统的癌细胞提供了一种快捷灵敏的检测方法，对癌症的诊断和治疗具有较大的作用。Lee等［80］利用SPR适体生物传感器检测视黄醇结合蛋白4(RBP4)用于二型糖尿病的诊断。该种方法避免了传统免疫学检测的测定干扰，可直接用于血液中RBP4的检测。Huang等［81］采用适体-纳米金实现了对乳腺癌标志物PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB的检测，其检出限均能达到纳摩尔水平。Medley等［82］以适体修饰的金纳米粒子实现了急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞的检测，并使用伯基特淋巴瘤Ramos细胞做对比检测，探针对靶标细胞有特异识别，其检出限为90个癌细胞。该纳米比色探针的选择性和灵敏度令人满意。与传统方法相比，比色法用于蛋白质分子检测有明显优势，如所需药品及材料均较廉价，避免了生物分析中的复杂修饰和分离，不仅保证了适体与靶分子的高度亲和性，还极大地简化了分析检测步骤，能很好的满足对现场快速检测的需求。相信这种方法将以其高灵敏、低成本和较简便等优势在生物分析和医学检测等领域得到广泛应用。与比色法相比，荧光法由于灵敏度高、特征参数多、动态范围宽和适体与纳米粒子作用方式灵活多样等优点，而更具发展潜力。最常见的光学分子信标就是发卡式分子信标，即适体序列的两端分别标记一个荧光团和淬灭团，当靶分子与特异序列结合后，原本相近的荧光团和淬灭团分开，进而显示出荧光信号。
另一种是在一个已知DNA序列上分别配合带有荧光团和淬灭团的DNA序列，当靶分子与适体进行特异结合后，淬灭团序列离开，而显示出荧光，并用于检测靶分子［83］。Huang等［84］将与DNA具有亲和性的DMDAP加入到PDGF适体修饰的纳米金溶胶中发生荧光淬灭，靶分子PDGF的加入使DMDAP释放到溶液中，进而荧光恢复，实现了对PDGF的荧光检测，其检出限可达8pmol/L。量子点与适体的结合则大大提高了其在细胞研究中的功能，为癌细胞的影像诊断技术及细胞内的药物转运提供了可能。Bagalkot等［85］发展了由阿霉素、适体和CdSe/ZnS量子点组成的双荧光共振能量转移体系，并将其成功应用于体外前列腺癌细胞的影像、治疗和药物运输。由于荧光检测法固有的高度灵敏性和多种纳米材料技术的使用，荧光生物传感在生物医学领域的研究将有更大的发展和应用空间。Zhang等［86］将钌联吡啶衍生物作为标记物，连接到发卡式DNA上制成电化学发光探针，将其自组装到金电极上构成新型电化学发光传感器，根据杂交前后电化学发光信号强度的不同进行目标序列的检测。实验结果表明，该发卡式DNA电化学发光传感器有较高的杂交特异性，能够识别单碱基和多碱基错配序列，检出限为9×10－11mol/L。该传感器具有较高的检测灵敏度，且无需对目标分子进行标记，有望应用于疾病检测等医学领域。Huang等［87］将含有15个碱基的巯基适体固定在金电极表面，用以结合凝血酶;另以29个碱基的生物素修饰的适体与凝血酶杂交形成夹心型结构。用亲和素修饰的量子点对生物素-亲和素的作用进行检测，制备了一种新颖的化学发光适体传感器。该传感器对凝血酶的检测线性范围为0～20mUg/mL。Pollet等［88］首次将光纤SPR传感器与DNA适体相结合制备了一种可重复使用、经济而非标记的适体传感器用于研究DNA杂交及DNA-蛋白质之间的相互作用。该传感器不仅可对DNA和蛋白质进行定量，而且还可以用于研究它们结合的动力学常数。#p#分页标题#e#
2．3质量型适体传感器
质量型适体生物传感器是非标记的生物测定技术，包括微波传感器、石英晶体微天平、表面声波装置和微机械悬梁式传感器。微重石英晶体微天平常用于检测靶分子与适体之间的相互作用。Tombelli等［89］和Hianik等［90］将生物素化的适体固定在金/石英晶体表面用于测定凝血酶和HIV-1Tat蛋白，其检出限分别为1nmol/L和0.25μg/L。机械悬梁式生物传感器具有较高的分辨率和稳定性。Savran等［91］将2个相临近的悬梁臂上分别功能化相应的适体，一个用ssDNA阻塞，一个用以测定TaqDNA聚合酶。结果表明，聚合酶与适体的结合产生了3～23nm的悬臂弯曲，且弯曲的程度与聚合酶的浓度直接相关。Hwang等［92］用纳米机械悬梁式传感器研究了RNA适体与hepatitisCvirus解螺旋酶的相互作用，对HCV解螺旋酶的检出限达到100pg/mL。Yang等［93］将含有20个碱基的ssDNA通过巯基固定在金表面制备了悬梁式DNA传感器，用于研究DNA的杂交。结果表明，该传感器能区分靶分子并为高通量实时监测DNA提供了可能。Yao等［94］以QCM适体传感器测定人血浆中的IgE，其线性范围为2.5～200mUg/L。该传感器具有较高的特异性、低检出限、样品量少的优点，适于特异性蛋白质的检测。质量型适体生物传感器与传统检测方法相比，不需要任何标记，仪器简单、操作方便、响应灵敏、选择性好和便于自动化，将在生物医学领域的检测上发挥越来越重要的作用。
3展望
生物亲和型传感器是以生物分子之间的特异性相互作用建立起来的一种新型传感器，在生物医学研究和临床应用上具有极大的应用前景。虽然现在亲和型生物传感器在实际临床诊断方面还存在抗干扰能力弱、多目标检测物同时检测能力差等缺点，但近年来光电化学、分子生物学、材料科学及电子学等多学科的融合与交叉，为亲和型生物传感器在生物医学上的研究与应用提供了无穷的发展空间。今后亲和型生物传感器的研究应用将主要集中在以下几个方面:不断开发新的杂交指示剂，或与多种检测方法联用来制备形式多样的亲和型生物传感器;设计更简单的制备方法来构建亲和型生物传感器，使其使用寿命更长，检测灵敏度更高;充分利用纳米材料的特异性能，结合微流控技术等实现传感器的微型化、芯片化，使其自动化程度更高，检测效率更好。总之，相信随着材料科学、生物化学、分子生物学和新型操控技术的进一步融合，亲和型生物传感器在生物医学的研究和临床诊断方面的应用将会有更大的进展。
