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本文作者：张路遥 牛婉婷 杨昊 潘敏 单位：浙江大学生物医学工程
量子点(quantumdots,QDs)是一种荧光半导体纳米晶体,直径1~100nm。量子点主要由Ⅱ~Ⅵ族元素(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ~Ⅳ族元素(如InP、InAs等)组成,目前生物医学领域研究常用的水溶性量子点主要是CdX(X=S、Se、Te)[1]。由于量子限域效应量子点具有独特的光学特性:耐光漂白、激发光谱宽、发射光谱窄且随粒径大小的改变而改变。所以,不同粒径的量子点可以在同一激发光的激发下发射不同颜色的荧光,有望解决传统染料在复色检测中存在的光谱覆盖、不能同时激发等问题。1996年,Alivisatos[2]解决了量子点作为生物探针与生物分子之间的相容性问题,实现了量子点在生物领域的应用。1998年,Chan等[3]实验证明量子点作为荧光标记物有传统荧光染料20倍的亮度、100倍的抗光漂白能力、1/3的发射半峰宽,从此,量子点成了最有前途的荧光标记物之一。经过修饰的水溶性量子点,表面可与多种生物分子结合,从而获得功能基团;基于量子点的探针和检测系统可广泛应用于生物医学检测系统中;量子点的表面敏感特性在检验中也得到了应用[4,5];在荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技术中量子点作为供体也显示了传统荧光染料所没有的优点;量子点在各种新技术中的应用更显示了其巨大的潜力。本文将全面综述经过修饰的量子点在各方面的应用现状。
1量子点探针的应用
经过修饰的水溶性量子点具有免疫活性[3]和高度的特异性[6],可以作为荧光探针应用于荧光免疫分析。偶联了抗体的量子点探针可用于检测抗原或细菌、肿瘤等有表面抗原的病原体、细胞、组织,并且具有很高的灵敏度。另外,量子点对表面变化非常敏感,基于量子点的这一特性发展起来的荧光猝灭探针、酶活性探针也具有很好的实用价值。
1.1量子点荧光免疫探针用于抗原检测
Azzazy等[7]用亲和素量子点探针对生物素化的前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen,PSA)进行了检测,检测限低达0.38pg/ml。Ker-man等[8]改进了探针制备技术,将量子点与单克隆抗体通过亲和素-生物素偶联制成探针,从而可以利用双抗夹心免疫法直接对人血清标本中的PSA进行检测,其检测限可达0.25ng/ml,线性范围为0•25~100ng/ml。
1.2量子点荧光免疫探针用于细菌检测
Hahn等[9]报道了一种用量子点免疫探针检测大肠杆菌O157∶H7的检测技术。他们用链霉亲和素修饰的CdSe/ZnS核壳式量子点和生物素化的抗体偶联,这种探针可以特异性地识别大肠杆菌O157∶H7,检测限达2•08×107cfu/ml,比传统异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)灵敏度更高、稳定性更好。Yang等[10]利用不同颜色的量子点同时检测了两种病原菌:大肠杆菌O157∶H7和伤寒沙门氏菌S.Typhimurium。发射波长分别为525nm和705nm的两种量子点分别偶联大肠杆菌O157∶H7和伤寒沙门氏菌S.Typhimurium的抗体。该方法能特异性识别并定量检测混合体中相应的细菌,检测限为1×104cfu/ml。
1.3量子点荧光免疫探针用于肿瘤检测
Hu等[11]用PEG修饰的CdSe量子点实现了细胞表面肿瘤标记物-癌胚抗原(carcinoembryonican-tigen,CEA)的检测。PEG量子点通过静电吸附偶联CEA抗体rch24。这种探针能比传统的FITC标记更有效地检测LS180细胞系表面表达的CEA。Yu等[12]用CdSe/ZnS量子点偶联鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)抗体来识别肝癌标记物AFP,量子点-AFP抗体探针通过尾静脉注射到小鼠内。点对点激光照射获取肿瘤部位和正常组织的荧光信号:荧光主要分布在肝癌组织上,周围组织的荧光强度迅速下降,基本无非特异性分布。
1.4量子点荧光探针猝灭的应用
量子点表面修饰有生物活性的酶之后,基于量子点对表面敏感的特性,可以用于检测酶底物的浓度。Ji等[13]报道了一种新颖的基于CdSe/ZnS量子点-有机磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)探针的生物传感器。其荧光猝灭程度和有机磷的浓度成线性相关,检测限可达10-8mol/L。增大OPH和量子点的比例能够增加传感器的灵敏度,但是当量子点表面结合的OPH已经饱和后,探针灵敏度不再增加。该方法为有机磷的检测提供了新途径,极具实用价值。
2量子点FRET在检测中的应用
FRET是一项应用能量转移来测量分子级别的距离的技术。当供体发射的荧光与受体的吸收光谱重叠,并且供受体之间的距离很近(<10nm)时,供体受激发产生的偶极子震荡就会引起受体偶极子的共振,发生这种非放射性的能量转移[14]。FRET对供受体间的距离非常敏感[15],可以用来检测蛋白质、核酸的分子结构和距离的微小变化。量子点作为FRET供体相对于有机荧光染料在灵敏度方面有很大的优势:量子点的激发光谱宽,可以选择产生背景荧光少的激发波长段来进行检测,量子点-有机染料-FRET探针可产生相对背景荧光更显著的荧光信号,从而能够检测到较低浓度的目标,并且多余的探针并不影响检测效果,操作起来更为方便。
2.1量子点FRET在DNA检测中的应用
基于量子点检测DNA的方法很多,大部分量子点DNA探针是用量子点作为供体、有机染料作为受体的。Zhang等[16]介绍了一种超灵敏的、基于量子点荧光共振转移的DNA检测方法。该方法可以用于检测未分离的低浓度DNA。量子点修饰一段DNA单链,有机染料Cy5标记另一段DNA单链,Cy5作为受体,量子点作为供体,二者与目标DNA结合,从而发生FRET。与同样用FRET技术的分子信标法相比,量子点作为供体背景荧光更少,灵敏度更高(4•8fmol/L),目前已成功检测基因点突变。
2.2量子点FRET在蛋白浓度和酶活性检测中的应用
Ma等[17]发现FRET可以用于检测溶液中鼠源IgG的含量。红绿两种不同颜色的量子点先后加入到IgG溶液中与IgG通过静电结合后可以观测到FRET现象的发生。FRET增强的程度和IgG浓度成线性相关,线性范围在0•1~20•0mg/L。在此FRET体系中加入木瓜蛋白酶后,IgG酶解,两种量子点之间的距离增大,FRET也随之消失。从另一个角度考虑,FRET也可以用于酶的活性检测。基于这一原理,Xu等[18]将Cy5-底物-量子点FRET探针用于β-内酰胺酶的活性的检验,检测限32μg/ml。这种酶是细菌产生的,其活性与细菌的抗药性相关,在检验β-内酰胺类抗生素药效方面具有很重要的临床意义。
3量子点在新技术中的应用
#p#分页标题#e# 3.1量子点化学发光共振能量转移在微芯片毛细管电泳中的应用
微芯片毛细管电泳(microchipcapillaryelectro-phoresis,MCE)是基于微机电加工技术在芯片上的微管道中完成电泳检测过程的新型技术,常用紫外吸光度分析法对样品进行检测。Zhao等[19]用鲁米诺-NaBrO-量子点化学发光共振能量转移(chemilu-minescenceresonanceenergytransfer,CRET)系统改进了微芯片电泳的检测技术。某些生物组分能有效抑制鲁米诺供体、CdTe量子点受体之间的CRET,Zhao等利用CRET的这种猝灭机制检测了人红细胞中的生物胺、硫醇类、氨基酸类、有机酸、胆固醇等5类生物分子,检测限10-8~10-9mol/L。采用CRET技术的MCE不需要激光光源,而且比采用其他检测技术(电泳图谱、化学发光等)的MCE灵敏度高10~1000倍,是一种很有发展前景的检测技术。
3.2量子点为基础的蛋白质芯片技术
蛋白质芯片技术是一种新型蛋白质分析技术,仅需微量样品,就可以同时检测、识别不同的生物分子,具有集成、并行、快速和自动化分析等优势。可以直接测量血浆、细胞裂解液等样品。Zajac等[20]将单克隆抗体固定在硝化纤维包被的玻璃板上,制成了蛋白芯片。用量子点QD655结合二抗作为探针,实现了对血清或者血浆中肿瘤坏死因子、白介素-8、白介素-6、趋化因子巨噬细胞炎性蛋白-1β、白介素-13以白介素-1β6种肿瘤标志物的微量测定,白介素-8和肿瘤坏死因子的检测下限可达到10~100pg/ml,其他四种肿瘤标志物的检测下限也达到了ng/ml的量级。将待测样品固定在硝化纤维涂层上的芯片技术称为反相蛋白芯片,由于待测样品是固定的,与普通蛋白芯片相比,这种芯片技术需要的样品量更少。Shingyoji等[21]用量子点探针改进了反相蛋白芯片的检测技术,该技术在少量粗制细胞裂解液中能够精确测量目标蛋白DNA-PKcs的浓度,灵敏度可以和传统的酶比色法媲美。Geho等[22]用量子点标记、高光谱成像技术作为反相蛋白芯片的检测技术,实现了JurkatT细胞淋巴瘤的识别。该方法无需放大和预处理可直接检测信号蛋白的浓度,并且动态范围大于传统比色法。最近,Hu等[23]实现了在反相蛋白芯片中通过复色量子点同时检测多种肿瘤标记物的技术,该技术具有足够高的灵敏度,可以直接检测血清中的肿瘤标记物。量子点这种在复色高通蛋白芯片中的应用,将成为肿瘤诊断的重要手段,是一个令人瞩目的研究方向。
3.3量子点与磁富集结合
量子点探针与磁富集结合可以大大提高量子点检测技术的灵敏度。免疫磁珠能够在浓度低的样品中快速捕捉富集目标生物分子和病原体,量子点作为荧光标记物可以解决传统磁性微球自发荧光干扰目标信号的问题。Agrawal等[24]用这种方法检测了培养液中的肿瘤坏死因子。该方法检测限达10-15mol/L,其灵敏度是传统免疫富集分析的1000倍、有机荧光免疫分析的100倍。Wang等[25]通过类似方法检测了培养液中的单增李斯特菌,检测限低达2~3cfu/ml,远高于前面提到的只用量子点探针[9,10]的检测技术。
4小结与展望
量子点作为生物医学检测与诊断中的新技术,具有广阔的发展前景。随着量子点标记、检测技术的不断发展和完善,必将成为新一代荧光标记物,用于疾病诊断、病原检测、药物筛选、肿瘤检测等多个方面。但是要真正实现量子点在各方面的应用,需要解决的问题还有很多:
(1)量子点比传统荧光染料要大,产生的空间位阻比较明显,有时候要考虑用长链分子偶联消除空间位阻[26]。
(2)某些被测目标的表面结构可能会阻止量子点的偶联,这时候要考虑对被测目标进行预处理,如炭疽杆菌孢子的检测[27]。
(3)水溶性量子点与功能基团(如抗体、生物素等)的偶联数量关系也是一个值得研究的问题。
(4)量子点存在闪烁现象,单一量子点的稳定性还有待提高。
总而言之,量子点是一种很有潜力的荧光标记物,特别是基于多色量子点并行检测多组分的微芯片技术,集多种技术的优点于一身,具有非常广阔的发展前景和应用价值。
