前言：寻找写作灵感？中文期刊网用心挑选的藏酋猴FY基因的克隆，希望能为您的阅读和创作带来灵感，欢迎大家阅读并分享。
藏酋猴Macacathibetana隶属哺乳纲Mammalia灵长目Primate猕猴属Macaca，是我国特有物种。藏酋猴分布范围广，仅次于恒河猴，主要分布于四川、西藏东部、甘肃东南部、陕西南部、重庆、云南东北部、贵州、湖南、湖北西北部、广西、广东、江西、安徽、福建和浙江等地，是世界少数几种自然分布区几乎全部在北回归线以北的灵长类物种(蒋学龙等，1996)，各种生理学特点与人相似，是一种理想的实验动物(《四川资源动物志》编辑委员会，1984)。达菲抗原/趋化因子受体(DuffyAntigen/Rece-porforChemokines，DARC，又称为Duffy，简称FY)编码血红细胞表面上的一个趋化因子受体，是7次跨膜的G蛋白非偶联糖蛋白即达菲蛋白，是1950年Cutbush等在多次输血溶血的病人血清中利用同种抗体首次检测到的一种糖蛋白。根据FYmRNA剪并与否，可将Duffy多肽分为主要(336aa)和次要(338aa)的两种形式(Toumamille，2000);该受体是已知的疟原虫Plasmodiumvivax的一个结合点(Tungetal.，2009)。近年来，随着免疫学和分子生物学技术更新进步，对达菲蛋白的研究更加深入。2004年起相继报道:增强内皮细胞mDuffy的表达能使受损血管生成、维护内稳态及应激能力增强(Tournamilleetal.，2004);缺乏Duffy的小鼠不能与CXC趋化因子结合而引起肿瘤病例增加(Lentsch，2006);乳腺癌病例人群样品研究显示，Duffy高表达的个体几乎没有淋巴结转移并且死亡率也很低(Wangetal.，2006)。可见Duffy的表达对机体的免疫起着至关重要的作用。2009年《Nature》发表:狒狒FY基因的功能性变异形式与在人类中所看到的变异形式不同源，并且狒狒FY基因的变异是疟疾类寄生虫“肝囊虫”易感的一个关键决定因子(Tungetal.，2009)，再次引起更多人对达菲蛋白和疟疾的关注。疟疾一直是全球性的健康问题，约40%的人口生活在疟疾流行地区，每年有几百万人死于此疾病(Muelleretal.，2009;Guerraetal.，2010)。间日疟原虫是引起人类疟疾的疟原虫之一，达菲蛋白是间日疟原虫感染的受体。研究人员试图研究一种切实可行的新方法，通过免疫结合反应来预防和治疗疟疾。目前已明确人类FY基因定位、分布和部分生理学功能(赵书平，2001)，但对藏酋猴FY基因的生物学性质未见有报道。鉴于藏酋猴的地域特点和与人的亲缘关系，本研究对藏酋猴的FY基因进行克隆、序列分析和蛋白质结构性质预测，为进一步探讨该基因对疟疾的预防和治疗提供基础数据。 1材料和方法 1.1试验材料 藏酋猴肌肉样本采集于四川省雅安市碧峰峡野生动物园自然死亡个体，冷冻保存带回实验室，贮存于－80℃超低温冰箱。PCR所需MasterMix酶和ddH2O均购自东盛公司;DNA凝胶纯化试剂盒和引物合成由上海生工生物工程有限公司提供。 1.2标本预处理 取保存的藏酋猴肌肉组织少许(约30～50mg)，放入1.5mL离心管中，加入0.9%生理盐水100μL，剪碎组织块;再加入700～800μL生理盐水，放置24h，期间更换5次;将最后一次生理盐水吸出后，加入10×TE800μL溶液，置换2次;最后将TE溶液吸干净。 1.3基因组DNA提取 DNA的提取按常规酚-氯仿法进行(Sambrook，1989)。所提DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳，Green-View核酸染料染色，于紫外透射仪上观察估计浓度和纯度。 1.4引物设计与合成根据GenBank中搜索出的FY基因序列，包括恒河猴(Macacamulatta，HQ285849.1)、人(Homosa-piens，NM_002036.2)、狨猴(Callithrixjaachus，XM_002760156.1)、大猩猩(Gorillagorilla，JN544134.2)、犬(Canisfamiliaris，XM_536127.3)、牛(Bostaurus，BC142464.1)相对保守序列，利用Primer5.0生物软件设计2对特异性引物，序列如下:引物1:FY1-F:5'-CCTCATTAGTCCTTGGCTCTTATCT-3'FY1-R:5'-ACCATACCAGACACAGTAGCCCA-3'引物2:FY2-F:5'-CCTCAACTCAGAACTCAAGTCAGC-3'FY2-R:5'-TCTCCCCAGACAAAATAAGAAACC-3' 1.5PCR扩增 用设计的引物扩增FY基因，当模板DNA浓度为50ng/μL时，通过反复试验，摸索配置了一套同时适用2对引物的有效扩增FY基因的PCR反应体系:基因组DNA(50ng/μL)2.0μL，Primers(10μmol/L)各1.5μL，ddH2O25μL，MasterMix酶20μL，总体积50μL。PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s，61℃退火35s，72℃延伸45s，36个循环;72℃延伸5min，4℃保存。取1μL的PCR产物，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，经GreenView核酸染料染色，在凝胶成像系统下检测并拍照。之后采用DNA胶回收试剂盒对凝胶产物进行回收后，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。 1.6序列分析 所测序列用Chromosoma1.62，DNAStar软件包中SeqMan、EditSeq、Megalign软件进行人工校对和编辑，确保序列无误。序列确定后，DNA序列的ORF查找和编码预测分别采用ORFfinder软件和GenScan软件;序列的相似性比较采用Blast软件;多序列的比较分析采用ClustalW软件;绘制进化树采用MEGA5.0;蛋白质的结构与特征预测采用Pre-dictProtein软件;氨基酸序列疏水性分析采用DNA-MAN软件;采用MEGA5.0软件，计算序列间碱基对的差异、转换/颠换数及其比值。进行数据分析时在GenBank中引用了6个物种的FY基因序列:人、恒河猴、牛、兔(Oryctolaguscuniculus，FJ811765.1)、犬和大熊猫(Ailuropodamelanoleuca，XM_002927274.1)。 2结果 2.1测序结果和序列特性 根据恒河猴FY基因序列特点，采用2对引物分段进行扩增，中间重叠对接。经PCR扩增后，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，在DL2000marker近1～2kb间均有特异性的产物带，与预期约1.1kb和1.2kb的产物相近，初步估计为所需产物。将PCR回收产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序结果经人工校对、序列拼接，所得序列为1491bp。与GenBank中恒河猴的FY基因序列(HQ285849.1)比较后，确认本试验所克隆序列是藏酋猴FY基因DNA序列，含有完整的2个外显子，大小分别为21bp和990bp，两外显子之间有1内含子，大小为480bp。该序列已提交到GenBank(登录号为JQ037908)。藏酋猴的FY基因CDS序列和预测的氨基酸序列如图1所示，ORF序列为1011bp，编码336个氨基酸残基，起始密码子和终止密码子分别为ATG和TAG，A、T、G、C的平均含量分别为15.63%、26.14%、27.40%、30.56%，G+C含量较高，为57.96%，A+T含量为42.04%。对藏酋猴FY基因蛋白质预测显示，其分子量为35.52kDa，pI为5.77，在pH7.0时的带电荷量为－4.95。该蛋白含有161个非极性氨基酸残基(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸)和79个极性氨基酸残基(天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)，以及17个带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)和11个带正电荷的氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)。拓扑结构预测如图1所示，藏酋猴FY蛋白上有15个潜在的功能位点:3个N-糖基化位点(16NSSQ，27NFSY，33NDSF)，2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(35SFPD，327SHLD)，10个N-肉豆蔻酰化位点(72GILASG，119GLGNTR，138GSAFAQ，148GCHASL，160GQVPGL，168GLSVGL，189GASGGL，224GLFGAK，230GLKKAL，257GVVLGL)。整个蛋白质多肽链含有7个跨膜螺旋区(位于64～83，92～116，135～154，163～187，208～227，234～253，284～307)，4个细胞外区(位于1～63，117～134，188～207，254～283)和4个细胞内区(位于84～91，155～162，228～233，308～336)。人、恒河猴、牛和犬的达菲蛋白的功能位点见表。采用DNAMAN软件按默认值参数对藏酋猴FY蛋白质氨基酸序列进行疏水性分析，结果见图2。由该图谱可知，藏酋猴FY蛋白质氨基酸序列的大部分区段都为疏水区，亲水区段有23个，其中大的区段只有3个(位于8～26，28～44，322～336)，包含的氨基酸残基数为15～19个，其余的均为小区段或点(位于4～6，52，56～57，60，87～88，91～93，119～125，152～153，156～158，190，199，201～202，204，206，229～231，234，238～241，254～255，280～281，309～312)，包含的氨基酸残基数仅为1～7个，所有亲水性氨基酸残基数(97个)占总氨基酸残基数(336个)的比例约28.87%。结合胞内外所处位置，在23个亲水区段中，除了87～88，156～158，229～231，309～312区段位于胞内区域，91～93，152～153，238～241区段位于跨膜区域，其余各亲水区段均位于胞外区域。进一步预测可知，该蛋白总平均疏水性(Grandaverageofhydropathicity，GRAVY)值为0.689，不稳定系数是39.84，分子半衰期30h。这些结果表明，藏酋猴FY蛋白质为疏水性蛋白，其亲水性区段所占比例较小，但是主要位于胞外区域。#p#分页标题#e# 2.2序列比较 同源性比较结果显示，藏酋猴与人、恒河猴、牛、兔、犬和大熊猫6个物种FY基因编码区核苷酸序列间同源性别为94.7%、99%、75.2%、80.2%、74.5%、71.7%;与其他非人灵长类的同源性都在97%以上;氨基酸序列间同源性分别为92%、99%、89.8%、78.2%、90%、89.3%，与其他非人灵长类动物同源性都在95%以上。 2.3基于FY基因外显子构建系统发生树 基于7个物种FY基因编码序列构建的NJ系统发生树(图3)，该进化树被分成2个大的进化支。藏酋猴和恒河猴相似，与人类的亲缘关系比较接近，在同一进化分支上。 3讨论 本研究对藏酋猴FY基因进行了克隆测序和序列分析，结果表明藏酋猴该基因的结构与人类、恒河猴、大猩猩等灵长类动物一样，包括1个内含子和2个外显子，起始密码子ATG，终止密码子TAG。同源图37个物种FY基因外显子构建的进化树Fig.3PhylogenetictreeofFYgeneexonsofsevenspecies性比较结果显示，与人、恒河猴、牛、兔、犬和大熊猫6个物种FY基因编码区核苷酸序列间同源性分别为94.7%、99%、75.2%、80.2%、74.5%、71.7%;氨基酸序列间同源性分别为92%、99%、89.8%、78.2%、90%、89.3%，说明藏酋猴与其他6物种间特别是灵长类动物在该基因编码区核苷酸序列及其编码的氨基酸序列上均具有较高的保守性。FY基因具有多态性，在cDNA中第131核苷酸，FY*A型是G，FY*B型是A，因此在第44个氨基酸产生多态，在Fya为天门冬氨酸，Fyb为甘氨酸;FY抗原分为4种表现型(Iwamotoetal.，1996)，曾被认为FY阴型的红细胞可抵抗疟原虫裂殖子的侵入(Miller，1977)。最近在Madagascar地区试验显示P.vivax也能入侵Fy(a-b-)红细胞而感染疟疾(Ménardetal.，2010)。本研究藏酋猴与恒河猴的核苷酸序列在第131都是A，和亚洲大部分人群的FY基因型一致。藏酋猴与恒河猴的FY基因全序列比较发现，内含子有3个变异位点，分别是364(A突变为C)、367(T突变为C)、440(A突变为G);在第2外显子46与47位点之间插入3个核苷酸GAA，导致藏酋猴FY核苷酸序列编码氨基酸增加1个谷氨酸(E)。这些碱基的突变和插入导致和人的FY基因核苷酸序列在相应位点的碱基恰好一致。 达菲抗原是红细胞上间日疟原虫的一种趋化因子受体，间日疟原虫裂殖子表面具有达菲结合蛋白(Duffybindingprotein，DBP)，疟原虫藉此结合到红细胞表面达菲抗原上，并与之紧密连接而侵入红细胞从而引起疟疾(Michonetal.，2001;Parasoletal.，2001)。Tournamille等(2005)认为P.vivax和P.knowlesi侵入红细胞依靠与达菲抗原的相互作用，这种分子间的相互作用可为抗疟提供新方法。蛋白质结构和功能主要决定于氨基酸序列，氨基酸序列相似的蛋白质具有相似的结构和功能，但当蛋白质功能区的个别氨基酸发生改变就可造成整个蛋白质结构和功能的变化。氨基酸编码达菲蛋白的功能位点比较(表):藏酋猴达菲蛋白与恒河猴的功能位点组成完全一致，由于藏酋猴FY核苷酸序列编码氨基酸在第22与23之间增加1个谷氨酸，所以除“16NSSQ”外，位点数字标识比恒河猴的增加了1;人的达菲蛋白的功能位点与牛的、犬的差异较大;人的与藏酋猴的相比，N-糖基化位点完全一致，多3个功能位点，1个蛋白激酶C磷酸化位点(122STR)，1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(18SQLD)和1个N-肉豆蔻酰化位点(31GVNDSF)。蛋白糖基化影响免疫分子的结构和功能，从而影响机体对抗原的应答反应(朱立平，2001)，蛋白糖基化和很多疾病有关，艾滋病治疗的研究人员发现HIVgp120位点上寡甘露糖位点可成为潜在的治疗靶位点(Calareseetal.，2003);N-肉豆蔻酰化位点在真核生物高度保守(Farazietal.，2001)，恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(Plasmodiumfalciparumerythrocytemembraneprotein1，PfEMP1)上N-肉豆蔻酰化位点对疟原虫入侵红细胞间接地起促进作用(Rasketal.，2010)，藏酋猴达菲抗原上的N-肉豆蔻酰化位点是否与疟疾易感有关，尚未见相关报道。 Wang等(1998)以猕猴(恒河猴)作为动物模型，组构的恶性疟原虫DNA疫苗免疫刺激动物对疟原虫的攻击有一定的保护性。现多用恒河猴模型来评估抗疟候选抗原的免疫原性，但误差较大，一些候选苗对恒河猴保护作用强而用于临床试验保护效果较弱(钟辉等，2000)。藏酋猴与恒河猴相似，与人类亲缘关系更近，可以作为抗疟研究的动物模型候选物种。藏酋猴是我国特有物种，开展此研究对保护和开发野生动物资源、将野生动物转为标准化的实验动物，以及对疟疾的预防和治疗提供分子基础等具有一定的实际意义。