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精原干细胞(spermatogonialstemcells，SSCs)位于雄性动物睾丸的曲细精管基膜上，是精子发生的基础。它一方面可以自我增殖维持自身数目的相对恒定，另一方面可以经过数次有丝分裂后进入减数分裂，形成精母细胞，最终形成精子，既具有自我更新的潜能，又具有定向分化的潜能，是自出生后直至整个生命期间进行自我更新并能将基因传递至子代的唯一成体干细胞。近年来，国内外学者对SSCs进行了大量的实验研究，在SSCs的自我更新和分化的调节机制方面有了一定的新进展(Oatley＆Brinster，2008)，这使我们更好地阐明精子发生的机理，以及对其他组织中成体干细胞增殖分化的调节机制的进一步研究提供了依据。 1SSCs的生物学特性 SSCs起源于原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)，在靠近尿囊根部的卵黄囊内胚层发生。这类细胞多镶嵌在支持细胞侧面生长，呈圆形，具有比较大的细胞核，呈圆形或轻微卵圆形，胞质较少，核仁呈网状2～3个多靠近核膜存在，核内常染色质占绝对优势，为细密均匀的颗粒，异染色质很少，胞质内核糖体、线粒体较丰富，其他细胞器不发达，线粒体呈圆形或椭圆形，常数个聚集存在或者散布于靠近核膜的胞质区域内，内有板层状的线粒体嵴。在小鼠第11.5d胚龄时，PGCs迁移到生殖嵴，并在此增殖，13.5d胚龄时PGCs停止分裂。在雌性，PGCs启动减数分裂向卵母细胞分化;在雄性，PGCs在胎儿睾丸曲细精管被支持细胞包绕后变为生精母细胞(gonocyte)，经几天分裂后停滞于G0/G1期，并保留了干细胞的潜能直到出生。出生后不久，它恢复增殖并启动精子发生过程(Brinsteretal.，2002)，大约6d左右迁移至曲细精管基膜，成为以SSCs为主的精原细胞。SSCs的数量很少，在成年小鼠睾丸中约有108个细胞，其中约有2×104个是SSCs，仅占睾丸所有生精上皮细胞总数的0.02%～0.03%，此后始终维持在这个数量不变。在小鼠整个性成熟过程中，SSCs的数量呈渐进性增长，从出生到成年，SSCs的数量增加了约39倍(Shinoharaetal.，2000)。 2SSCs的特异性标志 目前对精子发生的分化过程已取得基本的认识，但对SSCs本身的生物学特性了解较少。因此，对SSCs主要分子标记的研究是对其进行分离、鉴定和生物学特性深入研究的前提。精原干细胞和其他干细胞表面的标志物存在一定的相似性，如SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、AP等(Gussonietal.，1999)。酪氨酸激酶受体c-kit表达于造血干细胞(haemopoe-iticstemcell，HSC)、胚胎干细胞(ES细胞)、原始生殖细胞(PGC)和减数分裂前生殖细胞，干细胞因子(stemcellfactor，SCF)和其受体c-kit在精原细胞的迁移、分裂和早期雄性生殖细胞分化中具有关键作用(Dobrinskietal.，1999);α6-整合素和β1-整合素在精原干细胞表面会形成二聚体，作为一种层粘连蛋白受体发挥作用，其也是鉴定精原干细胞的重要表面标志。Khaira等(2000)研究表明小鼠精原干细胞的表面标志可包括sidescatteralow，α6-和β1-整合素，CD24+，Thyl+，C-kit－av－整合素－，MHC-I－，CD9－等，而Kanatsu-Shinohara等还将EpCam+、CD34也作为精原干细胞表面特征。除此之外，还有很多对SSCs的分子标记的研究，现将哺乳动物睾丸SSCs的主要分子标记概括如下(表1)(Bartetal.，2010)。 3调控SSCs的主要进展 目前，科学家先后在体内和体外培养条件下研究了小鼠、大鼠、牛、羊、猪和人类等多种动物的SSCs的主要表型和维持体系。先后发现GDNF(Glialcelllinederivedneurotro-phicfactor，GDNF)、Plzf(poxvirusandzincfinger)、泛素、LIF(leukemiainhibitingfactor，LIF)等多种细胞因子和基因决定着SSCs的维持和分化。 3.1调控SSCs自我更新和分化的主要分子 3.1.1GDNF GDNF是第一个被确认的能够调控精原干细胞自我更新和分化的细胞因子，它是由睾丸支持细胞产生的，以旁分泌的方式作用于精原干细胞，其对精原干细胞自我更新的调控具有剂量依赖性(Mengetal.，2000;Jonathanetal.，2009;Spinnleretal.，2010)。支持细胞分泌的胶质细胞源神经营养因子能够使SSCs很好地协调自我更新与分化，GDNF是一个与转化生长因子β超家族相关的成员，也是一个对特定神经元起作用的营养因子，而这种因子可通过旁分泌的方式促进SSCs的增殖，且是一个调节多种细胞发育和分化的多功能信号分子(DeRooijetal.，2006)。GDNF发挥其调控功能的具体分子机制已通过微阵列技术获得。在培养基中培养6日龄老鼠的SSCs，SSCs能够正常表达GDNF，之后使一部分SSCs的GDNF表达受抑制，此时调控SSCs分化起点的基因也会受影响。由此得知，GDNF在SSCs的分化过程中起到了调控作用。GDNF的异常表达，或者支持细胞的过度表达会使A型精原细胞(type-Asinglespermatoonia，As)增多，同时抑制精子发生(Yomogidaetal.，2003)。因此，当小鼠中的GDNF过度表达时，会形成大量的精母细胞，经过大约一年的时间形成干细胞瘤(Mengetal.，2001);体内缺乏GDNF的小鼠，精子发生不能正常进行。由此得知，GDNF在SSCs的自我更新和分化过程中起到了重要的调控作用，GDNF过多会抑制干细胞的分化，引起干细胞的积聚甚至干细胞的损耗(DeRooijetal.，2006)。GDNF是调控精原干细胞体外自我更新的最基础生长因子，其调控作用具有剂量依赖性。研究显示，GDNF对mGSCs的自我更新的调控主要通过PI3K/Akt、Ras/Erk1/2、Src家族激酶等信号通路来实现(Heetal.，2009)。 3.1.2Plzf 转录抑制物家族POZ(poxvirusandzincfinger)的成员早幼粒细胞白血病锌指蛋白(promyelociticleukemiazincfingerprotein，Plzf)也与SSCs的更新、分化有关。研究表明，Plzf在luxoid突变老鼠中是破坏基因，通过正常luxoid突变的老鼠逐渐表现出SSCs的丢失(Buaasetal.，2004;Cos-toyaetal.，2004)。因此，Plzf基因对SSCs的更新、分化也起到了调控的作用。Plzf蛋白质存在于As、Apl、Aal精母细胞中。Plzf和Bcl6b都有阻止SSCs分化的作用，但只有Bcl6b受GDNF的控制(Oatleyetal.，2006)。通路下游因子Plzf和Bcl6b对SSCs的调控还有待研究，很有可能与辅阻遏物N-CoR和SMRT有关(Payne＆Braun，2006)。#p#分页标题#e# 3.1.3Nanos Nanos在果蝇中是最先被鉴定的一个母源效应基因。随后科学家发现在斑马鱼、线虫、蜜蜂、人等物种中都有Nanos同源物，它们的功能也都和个体发育或生殖细胞的发育分化。小鼠中含有3个Nanos的同源物，分别命名为Nanos1、Nanos2、Nanos3。其中Nanos1在小鼠胚胎、成体睾丸和脑组织中都有表达。Nanos1对小鼠性腺的发育不是必须的，或其功能可以被其他基因代替。而Nanos2和Nanos3是生殖细胞特异性的，其基因敲除的小鼠都不能形成正常的性腺。成体中Nanos2或Nanos3的缺失将导致生殖细胞的丢失(Tsudaetal.，2003)。Nanos3在胚胎期两性生殖细胞中都有表达，而Nanos2只在雄性细胞中表达，因此Nanos2是一个严格的雄性生殖特异性基因(Atsushinetal.，2007)。Nanos2不仅维持原始生殖细胞(PGC)和精原干细胞(SSC)的自我更新，而且是一种启动雄性程序性分化的内源性因子。 3.1.4泛素 泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白，它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质使其被水解。这一过程需要由泛素C水解酶(UCHs)及其同功酶(UCH-L1，UCH-L3)完成，它们在分子水平上发挥着相似的作用，包括降解细胞内蛋白、调节细胞分裂周期、参与应激反应及细胞的凋亡过程(Baarendsetal.，2000)。研究发现，组成UCH-L1、UCH-L3的氨基酸排列顺序52%相同，但是存在部位却有明显的差异，前者的mRNA在睾丸、卵巢和脑有高度表达(Kuriharaetal.，2001)，而后者的mRNA却几乎存在于所有的组织中包括睾丸和脑(Kwonetal.，2003)。通过观察UCH-L1缺乏的突变鼠发生SSCs的增殖会呈现渐进性的降低，最终导致精子发生过程的停滞(Kwonetal.，2004)。目前研究证实UCH-L1在SSCs进行自我更新时发挥作用，而UCh-L3却在精母细胞向精子细胞分化中发挥重要作用。 3.1.5LIF LIF是一种存在于各种组织和细胞中的多功能糖蛋白，具有诱导粒细胞白血病细胞分化、抑制胚胎干细胞分化等功能。其受体存在于细胞膜上，由二聚体组成包括与LIF结合的亚单位和跨膜转导蛋白IL6ST组成。LIF与受体结合可激活转录蛋白，进而调控干细胞的自我更新。实验中发现大鼠细胞LIF受体的缺失可导致神经干细胞的减少(Shimazakietal.，2001)。在睾丸里主要由生精小管管周细胞分泌，且在胎儿期到睾丸发育成熟过程中的生殖细胞上始终有表达(Dorvaletal.，2005)。在体外培养实验中用能分泌LIF的饲养层再添加神经生长因子(GDNF)或者用包含LIF和GDNF的培养基培养的SSCs可以形成集落并保持对数生长(Kubotaetal.，2004)。 3.1.6Piwil 基因Piwil基因家族在人类进化过程当中是高度保守的，Piwil2蛋白参与多种干细胞的自我更新，它可以调控干细胞特异性基因的表达，包括血小板生长因子、β-多肽、Slc2al及SSCs表面特异性受体Thy-1(CD90)、Itga6、Hsp90a等。Piwil2所调控表达的这些因子及受体广泛参与干细胞本身的增殖分化，参与细胞间的信息传导。经证实Piwil基因在SSCs高度表达，并有促进SSCs的自我更新的功能(Tokasetal.，2011)。 3.1.7Bcl6b 小鼠GDNF异常表达的实验中，有6个基因的分化表达水平明显降低(DeRooijetal.，2006)。其中Bcl6b基因对体外培养的SSCs起着十分重要的作用。Bcl6b基因缺陷小鼠表现出生精上皮的损伤，除此之外，SSCs的传导路径的信号也受影响。 3.1.8FGFR2 成纤维母细胞生长因子受体2(fibroblastgrowthfactorreceptor，FGFR2)的基因突变能使父方的某一个精原细胞的自我更新能力增强，并逐渐代替正常的SSCs，最终产生越来越多的突变细胞。然后通路下游因子FGFR2在SSCs的自我更新和分化方面也起到调控作用。由于成纤维细胞生长因子(FGF2)由支持细胞产生，这可能是另一种调控SSCs的好方法(Kuriharaetal.，2001)。 3.1.9其他调控机制 实验表明，当把多种生长因子添加到SSCs的培养基中发现当GDNF加入时SSCs会增多，而成骨蛋白4(bonemorphogenicprotein4，BMP4)和活化素A则会减少SSCs的数目，它们都是被支持细胞包围的蛋白质，都与增强SSCs的分化潜能有关(Naganoetal.，2003)。He等(2009)对有关SSC调控的主要信号分子及通路做了很好的综述(表2)。Dazl(deletedinazoospermia-like)RNA结合蛋白和视黄酸(retinoicacid，RA)在调控SSCs完成减数分裂形成精子过程中起到了非常重要的作用。RA和类视色素X受体也与精母细胞的分化有关。SCF-c-kit体系与A1的分化有关(DeRoo-ij，2001)。遗传学研究表明bcl-2基因家族在调控SSCs的存亡上起了很重要的作用，Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、A1/Bfl-1等促进细胞的生长，而Bax、Bak、Bad、Bim等加快了SSCs的凋亡(Fuchsetal.，2000)。STAT3决定着SSCs是否分化或增殖(Oatleyetal.，2010)。最近也发现一些非编码的RNA，尤其一些miRNA等与哺乳动物SSCs的自我更新和分化调控具有很重要的关系，如miRNA-21(Niuetal.，2011)。有关miRNA与生殖细胞发育分化的研究进展，本课题组已经进行过综述(华进联，张珊珊，2010)。 3.2SSCs发育的微环境(niche) niche为干细胞自我更新或存活的发育环境。在睾丸内，SSCs定居的特定niches主要由支持细胞(Sertolicell)、基膜(Basementmembrane)、小管周的肌样细胞以及生精小管外未确定的信号形成(图)，SSCs定位在基底室，Sertoli细胞间形成的紧密连接(Tightjunctions)将基底室和连腔小室分隔开。位于基底室的SSCs在一定的条件下通过三种分裂方式完成自我更新与分化，包括一个SSCs分裂成两个干细胞，即自我更新分裂;或者是分裂成一个干细胞和一个分化状态的细胞，即不对称分裂;以及分裂成的两个细胞都进入分化状态，即分化分裂。经分裂形成的分化状态的细胞逐渐分化成精母细胞(Spermatocytes)，最终形成精细胞(Spermatids)。整个分裂过程正是由于支持细胞及其周围的各类细胞形成的独特微环境，更好的调控SSCs更新和分化的比例，保证了SSCs的独特生物学特性。#p#分页标题#e# 4小结及展望 体外培养条件下，在合适的精原干细胞的培养体系中加入bFGF、GFRa1、GDNF等细胞因子可促进SSCs的增殖，并抑制其分化。但这种作用通常与精原干细胞来源小鼠的遗传品系特异性紧密相关;并且其培养体系中是否加入了血清也会对增殖、分化、移植有显著影响。因此，如何消除SSCs来源的品系特异性，建立无血清培养体系是研究的方向。另外，常规的SSCs培养需要饲养层细胞，目前常用的饲养层细胞有小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层和STO饲养层，它们均可产生抑制SSCs分化并维持其二倍体状态和多能性的因子，如GDNF。但由于其细胞系的动物来源和本身具有一定的免疫源性，使其使用受到限制，所以，建立高效的无饲养层无血清快速扩增体系是研究的重点。体外培养SSCs的突破性进展，会为我们更好地了解SSCs的分化和自我更新的机制奠定一定的基础。最近，多家研究小组以体外培养的方法从成年睾丸精原干细胞获得胚胎干细胞生物学特性的小鼠和人类雄性生殖干细胞，这进一步扩展了哺乳动物精原干细胞的应用。 虽然人们对SSCs自我更新和分化的调节、精子发生过程的调控已经有了一定的了解，如GDNF、SCF-C-kit体系、cy-clinD2、Dazl、RA、Bcl-2基因家族等都对SSCs的自我更新与分化起到调控作用，这些研究使我们能更好的了解SSCs。但目前迫切需要解决以下2个问题:(1)SSCs调控特定因子及其信号传导通路的发现与明确;(2)SSCs长期培养体系或细胞系的建立，尤其需要建立具有重要应用前景的家畜和人类SSCs细胞系。这些问题的解决，可望为深入研究男性不育的机制及临床治疗提供理论依据。