前言：寻找写作灵感？中文期刊网用心挑选的紫菜的无菌培养体系优化，希望能为您的阅读和创作带来灵感，欢迎大家阅读并分享。
紫菜是中国沿海重要栽培品种和主要经济藻种之一［1］。紫菜和紫菜藻际微生物之间存在着复杂的相互作用关系［2］。以往关于紫菜及其附生菌的研究多是集中在紫菜附生菌的分离、纯化和具有特殊作用微生物的培养与鉴定等方面［3－5］，为了进一步研究紫菜和其外生菌的关系，获得紫菜的无菌培养体系是非常必要的。本文借鉴国内外用抗生素排除藻类外生微生物的方法对紫菜进行无菌处理，并在此基础上研究紫菜附生菌对紫菜生长的影响。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1材料及材料预处理 本研究选用的紫菜叶状体为宁波象山鹤浦栽培品种(为坛紫菜)，于2008年11月采集，清洗晾干后，－20℃冰箱密封保存。将材料从冰箱中取出，放入消毒海水中，于室温复苏24～36h［6］，复苏后挑选健康的紫菜，在消毒海水中用棉球反复洗刷3遍，将清洗好的紫菜叶片打成直径6mm圆片，放入0.7%KI溶液中浸泡10min，经灭菌海水清洗3遍后，再放入0.1%(w/v)的氨苄青霉素溶液中浸泡10min，再经灭菌海水清洗3遍后，将紫菜叶片移入灭菌海水中光照培养2h。紫菜培养液为加入Ⅲ号营养母液的灭菌海水(营养母液∶灭菌海水=1∶1000)，海水取自宁波市奉化湖头渡，过滤后，121℃，20min高压湿热灭菌。Ⅲ号营养母液:100g/LKNO3、10g/LKH2PO4、2.5g/LFeSO4、0.25g/LMnSO4和20g/LEDTA-Na2，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。紫菜培养条件:温度为18℃，光照强度40～50μmoL/m•s，光周期(12h∶12h)。 1.1.2菌种来源 紫菜外生细菌对抗生素的敏感性试验菌株:为分离自不同地区的紫菜上的具有较强抑菌活性的菌株，见方文雅(2009)［7］。回染实验菌株为:13株从健康紫菜分离的Pseud-oalteromonas，6株从温州病烂坛紫菜及条斑紫菜周围海水分离的Bacillus和7株从温州病烂坛紫菜及周围海水分离的真菌。 1.2主要试剂 氨苄青霉素溶液(Ampicillin，100mg/mL，γ射线灭菌)，硫酸链霉素溶液(StreptomycinSulfate，30mg/mL，γ射线灭菌)，硫酸庆大霉素溶液(GentamycinSul-fate，15mg/mL，γ射线灭菌)，硫酸卡那霉素溶液(Ka-namycinSulfate，30mg/mL，γ射线灭菌)，硫酸新霉素溶液(neomycinSulfate，10mg/mL，γ射线灭菌)，均购自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.3抗生素的选择 1.3.1待除菌紫菜叶状体对抗生素的耐受性试验 将1.2所述5种抗生素分别加入到200mL待除菌紫菜叶状体培养液中，每种抗生素的浓度梯度分别为10、100、300、500、1000μg/mL。各种抗生素每个浓度做3个平行，以未加抗生素的紫菜叶状体为对照，每2d更换一次培养液，并追加相应抗生素到相应浓度。每天摇动培养液数次并观察紫菜叶状体的生长状况，连续培养6d，每次更换培养液都进行紫菜叶状体的无菌检测，选择对紫菜叶状体生长无明显影响的抗生素及浓度进行下一步实验。 1.3.2紫菜外生细菌对抗生素的敏感性试验 将已分离活化的紫菜外生细菌用无菌海水配制成107cfu/mL的菌悬液，将10μL菌悬液和90μL培养液移入96孔板，根据1.3.1实验结果分别加入选定的抗生素及浓度，每组设3个平行，以不加抗生素的菌液作对照，36℃培养18h使其达到对数生长期，加MTT(噻唑蓝)液10～20μL/孔(终浓度0.5～1mg/mL)，36℃温育4h后弃去培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)或乙醇(100μL/孔)，稍振荡待沉淀充分溶解，置酶标仪波长570nm，测定OD值，每组3个孔的OD平均值表示各组的细菌生长状况。选取对紫菜外生菌有明显抑制作用的抗生素作为除菌工具。 1.3.3组合抗生素排除紫菜外生菌 根据1.3.1及1.3.2选择合适抗生素以最佳终浓度(表1)对紫菜进行无菌化处理。1)抗生素逐种加入法:将待除菌紫菜叶片加入青霉素终浓度为300μg/mL的无菌培养液培养2d;然后用无菌镊子将紫菜叶片移入庆大霉素浓度为100μg/mL的新鲜无菌培养液，培养2d;再转入卡那霉素浓度为100μg/mL的新鲜培养液，培养2d;然后将紫菜叶片用无菌海水清新3次，转入新鲜的紫菜培养液中培养，进行无菌检测。2)抗生素混合加入法:按照表1所示抗生素组合组别分别对待除菌紫菜叶片进行无菌处理，每组设3个平行，以未进行无菌处理的紫菜叶片为对照，无菌处理18h后，用无菌海水清洗紫菜叶片3次，转入新鲜紫菜培养液培养3h后更换新鲜培养液，以彻底去除残留抗生素，再次转入新鲜培养液继续培养，观察紫菜生长状况，期间每2d更换一次培养液，每次更换培养液后均进行无菌检测。 1.4无菌检测 1.4.1培养基检测法 1)取已排除抗生素影响的紫菜培养液0.1mL，涂布2216E平板和PDA平板，分别以30℃培养2d、29℃培养5d，每组做3个平行，观察有无细菌及真菌菌落出现。2)取0.1mL紫菜培养液分别加入1mL液体2216E培养基和1mLPDA培养基内，分别以30℃培养1d、29℃培养5d，每组做3个平行，以未加培养液的培养基为对照，观察培养液是否浑浊。1.4.2荧光和扫描电子显微镜检测1)荧光显微镜镜检:将待检测紫菜叶片用0.22μm微孔滤膜过滤的0.1%(w/v)吖啶橙溶液染色10min后，用荧光显微镜(日本Olympus公司，型号BX－60)观察。根据荧光颜色区别菌体与紫菜细胞(紫菜活细胞发红色荧光而细菌发绿色到橙色荧光)。2)扫描电子显微镜观察:取已排除抗生素影响和未经无菌化处理的紫菜叶片，切成1mm2的小片，经清洗、化学固定、干燥、喷镀金属及日本日立公司型号S-3400N的扫描电子显微镜拍摄，观察有无微生物附着。 1.5紫菜外生菌对无菌处理后的紫菜叶片的人工感染 1.5.1细菌悬液及真菌孢子液制备 将培养到对数期的紫菜细菌用灭菌海水制备成初始浓度为106/mL的细菌悬液，将活化好的紫菜真菌用灭菌海水制备浓度为108/mL的真菌孢子母液，置4℃备用。#p#分页标题#e# 1.5.2低浓度菌液回染正常紫菜 取上述无菌紫菜组织片，用灭菌烘干的滤纸吸干紫菜表面培养液，吸取适量105/mL浓度的芽孢杆菌、假交替单胞菌菌液和真菌孢子液回染3h，用无菌海水清洗3遍，除去紫菜表面微生物，将接菌的各紫菜组织片分别置于6孔细胞培养板(COSTAR，ComingInc．USA)中，每孔加人10mL紫菜无菌培养液，置于光照培养箱，按紫菜最佳培养条件培养，定期观察其生长状况，每组设3个平行，以不加菌的无菌紫菜为对照。 1.5.3高浓度真菌孢子液回染不同状态的紫菜 配制108/mL真菌孢子液分别回染健康紫菜、穿刺紫菜(用灭菌刀片在紫菜表面划1～2mm的伤口)，分别在18℃、28℃和35℃条件下培养，光照强度为40～50μmol/m•s，光暗比为L∶D=12h∶12h，每组设3个平行，以不加菌的无菌紫菜为对照。 2试验结果与分析 2.1抗生素的选择 紫菜叶状体对抗生素的耐受性实验表明，硫酸链霉素对紫菜细胞毒害较大，对紫菜的生长具有一定的抑制作用，紫菜叶片培养4d后100μg/mL浓度组的存活率仅有50%，培养到第9d时基本上紫菜叶片全部变白死亡。氨苄青霉素、新霉素、卡那霉素和庆大霉素的性质相对温和，对紫菜叶片影响较小。紫菜外生菌的药敏测试结果(见表2)表明，氨苄青霉素、庆大霉素及卡那霉素均可明显抑制紫菜外生菌。氨苄青霉素对78.9%外生菌的抑菌率达80%以上;庆大霉素对73.7%外生菌的抑菌率达80%以上，卡那霉素对73.7%外生菌的抑菌率达80%以上，而新霉素的抑菌作用则相对较弱，仅对34.2%的外生菌的抑制率达80%以上。因此，最终选择氨苄青霉素(终浓度300μg/mL)、卡那霉素(终浓度100μg/mL)、庆大霉素(终浓度100μg/mL)用于紫菜无菌化处理。抗生素组合处理紫菜叶片结果表明:与抗生素逐种加入和两两合用的抗生素组合处理相比，采用氨苄青霉素(终浓度为300μg/mL)、卡那霉素(终浓度为100μg/mL)、庆大霉素(终浓度为100μg/mL)组合对紫菜的无菌化处理效果较好，并且3种抗生素组合处理紫菜外生细菌的试验表明，3种抗生素合用对89.5%紫菜外生细菌的抑菌率达80%以上(见表2)。 2.2紫菜无菌检测 取3种抗生素合用处理18h，转入新鲜紫菜培养液培养3h后的紫菜，经荧光显微镜检测(图1)发现，对照有大量菌体存在(细菌发绿色到橙色荧光)，而处理后的紫菜仅看见紫菜细胞(紫菜活细胞发红色荧光);经扫描电子显微镜观察(图2)发现未处理的紫菜表面有菌体存在，而无菌处理过的紫菜表面已经达到无菌状态;取3种抗生素合用无菌处理一次后过夜恢复培养的紫菜培养液0.1mL分别加入1mL液体2216E培养基和1mLPDA培养基内，结果发现2216E液体培养基变浑浊，PDA液体培养基内未见真菌生长。随机取3片未经处理的紫菜叶片和经过3种抗生素合用处理后的紫菜叶片，分别吸干表面水分，放入灭菌研钵中充分研磨，然后加入300μL灭菌海水，取100μL涂布2216E平板，30℃过夜培养，未经处理的紫菜平板内布满细菌，浓度可达到2×105cfu/mL，而经过3种抗生素合用无菌处理的紫菜叶片其上有少量细菌，仅150cfu/mL，即经过3种抗生素合用处理后的紫菜叶片仅有0.078%的细菌存在，可忽略不计，结果见图(图3)。这说明虽然紫菜经3种抗生素合用无菌处理后紫菜表面能达到无菌状态，但是并不能说明紫菜已经达到绝对无菌状态，或许是紫菜细胞内有寄生菌，该寄生菌并不能通过外部浸泡抗生素的方法除去。实验发现经过3种抗生素合用处理后的紫菜叶片仅有0.078%的细菌存在，可忽略不计，并且对紫菜细胞产生的影响很小。无菌处理后的紫菜叶片在无菌培养条件下初期生长状况良好到后期紫菜叶片逐渐变白死亡，而经紫菜外生菌回染的紫菜叶片生长状况良好，说明紫菜叶片的死亡并非由于无菌处理的化学因素所导致，而是源于其他因素。这也说明紫菜外生菌与紫菜的健康生长之间存在一定的关系。 2.3紫菜外生菌对无菌处理后的紫叶片的人工感染 用105/mL真菌孢子液和细菌菌液回染紫菜，培养22d后，实验组紫菜生长状况较对照组好，对照组紫菜出现褪色，结果见图(4)。用108/mL真菌孢子液分别回染正常紫菜和穿刺紫菜，实验结果表明高温和穿刺均会影响无菌紫菜健康生长，正常培养条件的加菌紫菜生长良好，而加菌紫菜在高温和穿刺条件下，则会出现明显病斑，结果见图(5)。该结果提示我们，低浓度菌液可能参与紫菜维持藻际微环境的平衡，并为紫菜提供了营养，从而促进其生长;紫菜病烂不一定是真菌造成的，处于恶劣环境的紫菜可能更容易受致病菌侵染而导致病烂。关于其影响原理有待进一步深入研究。 3讨论 为了研究藻和藻外生菌之间的相互作用关系，获得藻的无菌培养体系是非常必要的，先前国内外已有很多研究选择用抗生素除菌来获得藻的无菌培养体系。Druehl等采用较高浓度的组合抗生素(青霉素、硫酸链霉素和氯霉素)并配合次氯酸钠对海带等褐藻进行无菌处理，成功获得了无菌孢子体叶片［8］。Cottrell等采用单一抗生素逐种加入法进行微藻除菌成功获得了无菌微藻Micromonaspusilla藻种［9］。林伟利用青霉素、卡那霉素、链霉素和庆大霉素组合处理藻，获得了除菌球等鞭金藻，三角褐指藻及小球藻，并且除菌后的藻生长情况更佳［10］。由于各种藻的藻际微环境和藻际微生物各不相同，要根据藻类的实际情况来采取不同的除菌方法。本文利用紫菜及紫菜外生菌对抗生素的敏感性实验，最终选择氨苄青霉素(终浓度300μg/mL)、卡那霉素(终浓度100μg/mL)、庆大霉素(终浓度100μg/mL)三种抗生素组合对坛紫菜叶状体进行无菌处理，紫菜经0.7%KI和0.1%(w/v)氨苄青霉素预处理后，再经三种抗生素合用处理，可排除几乎全部的紫菜叶状体外生菌。