土壤功能微生物SIP鉴定

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传统的功能微生物鉴定方法是在含有特定碳源培养基上对目标微生物进行富集、分离与纯化，由于实验室可培养的微生物只占微生物总数的0.1~1%[1]，因此以纯培养技术为代表的鉴定方法存在很大局限性。20世纪后半叶，以分子生物学为特色的现代土壤微生物研究方法取得突破性进展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技术为代表的生物化学方法，以BIOLOG技术为代表的生理学方法和基于DNA多态性的微生物群落结构和功能多样性的分子生态学技术，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）、末端限制性酶切片段长度多态性分析（T-RFLP）和实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）等。上述技术提高了人们对土壤微生物群落结构组成的认识，但仍难提供有关微生物间相互作用及代谢功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指纹图谱方法只能检测环境样品中的优势微生物群落，但具有特定生态和环境功能的微生物通常在数量上并不占优势[3]。因此，功能微生物很难被这些分子指纹图谱方法所鉴别[2]。据估算，每克土壤含有约100亿个微生物个体，包括100万种不同的微生物种群。利用上述技术，从这些难以计数的土壤微生物中原位鉴别特定生态过程的微生物驱动者是难以想象的[4]。近年来得到广泛关注的稳定性同位素探针技术与现代分子生物学相结合，可以在相对未受干扰的环境样品中培养功能微生物，利用稳定性同位素示踪复杂环境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鉴定生态系统重要过程的微生物驱动者。其基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，土壤中利用该标记底物的微生物细胞在其生长繁殖过程中同化合成含标记元素的生物标志物。通过对生物标志物进行提取、分离、鉴定和比对分析，鉴别土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法可以准确获得功能微生物的目的基因，避免了从浩瀚基因库里一个个筛选目的基因的烦劳工作，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段。   1土壤功能微生物sip鉴定技术流程   SIP技术是耦合微生物遗传多样性与代谢多样性最有力的工具之一，该技术以复杂的原位或微宇宙土壤样品为研究对象，采用稳定性同位素原位标记土壤样品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前绝大多数研究采用13C标记底物培养土壤，利用13C-底物的微生物细胞不断分裂、生长、繁殖，合成含13C标记的DNA或RNA等生物标志物。提取土壤样品中13C-核酸和12C-核酸总混合物，用超高速离心技术将13C-核酸与12C-核酸分离，利用分子生物学手段对生物标志物进行分析，以鉴别土壤功能微生物。近年来，以15N和18O为基础的SIP技术也被成功应用于微生物驱动的土壤生态过程研究[6]。   1.1土壤SIP技术前处理方法选择   SIP技术前处理包括标记底物的培养和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取两个步骤。培养方式主要包括添加营养液富集培养和仅添加标记底物培养等方式。添加营养液富集培养法可以为微生物生长提供相对稳定的环境，并促进微生物的生长，以获得足够的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括试剂盒提取法和液氮研磨法等。试剂盒法操作简单，提取纯度高，但提取量较低，费用高。液氮研磨法可以较好保证DNA/RNA的完整性，提取量相对较高，且操作费用低，时间短，但需纯化后才能满足RT-PCR等后续分子生物学要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要为两种：一种是PLFAs法，即先通过氯仿-甲醇单相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再经硅胶柱纯化以及酯化作用得到活体细胞膜结合态FAME，提取的脂肪酸种类仅有El-脂肪酸，多为细菌所特有。另一种是TSFAMEs法，即通过碱甲醇分解法提取总土壤FAMEs。提取的脂肪酸种类包括酯连接和非酯连接PLFAs，多为真菌所特有[9]。   1.2土壤SIP技术中生物标志物的选择   土壤SIP技术中特定微生物的生物标志物为PLFA、DNA和RNA3种。PLFA-SIP法是将PLFA从重稳定性同位素（如13C）标记过的环境样品中提取出来，通过PLFA图谱分析微生物群落的结构和多样性，再通过气相色谱-燃烧-同位素比率质谱联用法测定各种PLFA中13C的丰度[7]。PLFA-SIP的标记底物浓度要求较低，灵敏度较高，但存在一些缺点：（1）对于未知PLFA分子图式的不可培养微生物，或者土壤中的某种特殊脂肪酸无法与特定种类的微生物相对应，该方法就无法鉴定功能微生物。（2）该方法在很大程度上依赖于标记脂肪酸来确定土壤微生物群落结构，标记上的变动将导致群落估算上的偏差。（3）细菌和真菌生长条件的改变或环境胁迫都能导致脂肪酸类型的改变[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可获得更直接的功能微生物遗传信息。DNA-SIP的优点是：标记的13C-DNA一定来自新产生的子代微生物细胞，是证明微生物原位生长并驱动生态过程的最直接证据。另外，DNA完美的双链结构保证了遗传物质的稳定[10]。DNA-SIP的缺点是：自然环境中能被微生物利用的底物浓度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用较高浓度的标记底物来刺激目标微生物的分裂繁殖，可能导致研究结果与原位自然环境的实际情况不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺点。自然环境中特定功能微生物发挥作用的同时，即使没有大量增殖生长，但具功能基因得到表达并在核糖体内合成蛋白质，获得标记的13C-RNA则表明微生物可能具有较强的活性。因此，RNA-SIP能够采用更低的标记底物浓度培养环境样品，研究结果更接近原位状况[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的实际应用仍存在较大的技术难度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的结合将会大大提升SIP技术的潜力。   1.3土壤SIP分离后的分析方法   13C-核酸与12C-核酸分离后，可以利用分子生物学手段对功能微生物的DNA/RNA进行分析，以鉴别土壤中重要生态过程的微生物驱动者。目前的主要分析方法包括分子指纹图谱法、实时定量PCR法和454高通量测序法等。（1）分子指纹图谱法是目前进行功能微生物的DNA/RNA分析的广泛使用的快捷方法，但分子指纹图谱分析方法的灵敏度较低。环境样品中微生物通常数以百万计，采用古菌或细菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能检测环境样品中数量上占优势的微生物[14]。具有较为重要的生态和环境功能目标微生物通常在数量上不占优势。因此，目标微生物同化利用13C-底物后发生的微小变化很难被分子指纹图谱法所鉴别。（2）实时定量PCR法直接针对目标微生物的功能基因，采用高度灵敏的实时定量PCR测定不同密度层级中目标微生物的数量，显著提高了SIP技术的可靠性。然而，采用特异引物定量研究目标微生物存在一定难度。土壤中数量众多的微生物基因组DNA可能被13C标记，很难采用单一的功能基因或16SrRNA基因特异引物，同时研究众多目标微生物在不同密度层级中的分布规律。我们无从得知哪一种微生物可能利用稳定性同位素标记底物，无法设计特异的功能引物，只能通过选择性定量目标微生物，明确目标微生物在不同密度层级中的分布规律，同时判定SIP技术的可靠性[13，15]。（3）454高通量测序法是通过检测各浮力密度层中微生物16SrRNA基因组成，分析目标标记微生物占该层总微生物的比例，从而鉴别前所未知的重要功能微生物。该技术可规避PCR扩增，直接对标记13C-RNA测序，每次分析可获得大约100万16SrRNA基因序列，显著增强了重浮力密度层中13C-标记微生物DNA序列的检测灵敏度。高通量测序可全面分析微生物群体的物种、基因功能组成，最大程度地认识未培养微生物的遗传组成和生命活动，是目前最准确的方法[16]。但该方法目前测试费用较高，后续数据处理复杂，但随着技术发展必将成为功能基因组学研究的主流技术。#p#分页标题#e#   1.4构建克隆文库   超高速密度梯度离心分离并鉴别13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文库，构建遗传系统发育树的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落组成，并比较二者的差别，鉴定被13C底物所标记的微生物群落。   2SIP技术在土壤功能微生物鉴定中的应用   目前SIP技术在土壤分子生态学研究领域主要应用在原位鉴定介导有机污染物生物降解和碳氮循环过程的功能微生物方面。有机污染物生物降解研究多集中于单环芳烃、PAHs和PCBs的研究，碳氮循环研究多集中于植物-微生物相互作用对陆地生态系统中碳氮转化、土壤中碳氮周转速率、稻田产甲烷机理及产甲烷菌的研究。   2.1SIP技术在土壤有机污染物生物降解研究中应用   在有机污染物生物降解的微生物生态学研究中，SIP技术可以帮助了解在复杂原位土壤环境中，参与各个降解过程和途径中功能微生物种类。Hanson等首次使用PLFA-SIP技术研究甲苯的生物降解，总共提取发现的59种PLFAs中有16种出现13C标记[17]。Christopher等在对农田土壤中苯酚降解菌的研究中，对13C标记苯酚的DNA进行18S-28S内转录间隔区的PCR扩增，T-RFLP分析，成功分离出一种白色细状的真菌，并证实该真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技术对13C标记苯酚的RNA反转录PCR和T-RFLP分析，新发现了3种苯酚降解菌。罗春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技术研究了甲苯、苯和间二甲苯的降解菌，对分离出的13C-DNA进行T-RFLP分析、克隆文库的构建，获得了相应的降解菌，并首次报道了TM7门对甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技术鉴定甲苯退化细菌，鉴定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地区的田间试验中，向受试的粉砂壤土供应13C标记的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通过GC/MS监控土壤中释放的13CO2浓度，以此估测底物降解速率，并将分离得到13C-DNA用通用引物对16SrRNA基因进行PCR扩增，最终得到29个完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技术，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6种多环芳烃功能的微生物群落，将13C作为标记元素，构建13C-DNA的16SrRNA克隆文库和RT-PCR分析，结果表明不可培养菌PG2不仅可以降解芘，还能降解荧蒽和苯并[A]蒽，从而说明PG2菌对四环PAHs有着良好的降解效果[6]。Tillmann等设计了一个PLFA-SIP微宇宙实验，将PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯联苯中，采用GC-C-IRMS测定不同PLFA13C的丰度，结果表明非优势菌在PCBs好氧降解过程中的主导作用[25]。Shahid等在对五氯酚降解菌的研究中，比较了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技术的鉴定效果，结果表明RNA-SIP技术可以更好反映功能微生物群落的变化趋势[11]。Sul等将DNA-SIP和宏基因组技术结合，对13C-联苯-DNA中芳烃双加氧酶基因片段PCR扩增，得到两串与bphA相似的序列组，构建1568粘粒克隆文库，发现除含bphAE基因外，还含有属于γ-变形菌纲的未知基因片段，该片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平转移而形成的[26]。   2.2SIP技术在土壤C循环中的应用   土壤C转化是微生物主导的生物地球化学过程，SIP技术能够很好地将微生物群落与其功能联系起来，加深人们对陆地生态系统重要C循环过程的认识。Boschker等最先使用PLFA-SIP技术进行甲烷营养菌的研究[7]，随后，DNA-SIP技术被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活性功能种群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4对取自罗马尼亚MovileCave地下水系统的样品进行短期培养，以DNA-SIP技术为前提确定了3类含有编码甲烷单氧化酶基因的甲烷营养菌，并通过与非甲烷营养菌比对证明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究养分添加对甲烷营养菌多样性的影响时，人工添加养分在一定程度上可避免交叉取食，改进了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松树林土壤中的甲烷营养菌群落结构组成与CH4氧化率的联系，并简短讨论了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英国不同陆地生态系统土壤中氯化甲烷营养菌的多样性，通过与培养分离法的结果比较，揭示出土壤中仍存在大量不可培养的卤化甲烷营养菌，并将卤化甲烷的全球循环同一组目前已知的卤化甲烷营养菌特征群联系了起来[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技术进行甲醇营养菌的研究，通过13CH3OH培养森林土壤，证明被13C标记的细菌16SrRNA基因序列与已知可培养的甲醇营养菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此类细菌还存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技术证明了稻田土壤中，甲酸盐中的C首先被光营养的初级和次级生产者利用，随后产生的有机物被其他微生物利用[31]。陆雅海等用13CO2对水稻进行脉冲标记培养，利用RNA-SIP技术与T-RFLP分析，获得水稻根际的产甲烷菌，并通过厌氧和好氧条件的对比，表明根际环境和降解过程的多相性[32，13]。该团队还利用PLFA-SIP描述了水稻根际微生物活性的空间变化，提出在根际革兰氏阴性菌和真核微生物在同化根派生碳过程中最活跃，同时描述了围绕根际的活性群落的空间系统变化[9]。   2.3SIP技术在土壤N循环中的应用   15N作为生物体内大分子合成的组成元素，可结合SIP技术研究土壤中氮循环过程的各类微生物功能群及其相互作用。Georg等利用标记和未标记的N进行纯微生物培养，结果显示15N-DNA-SIP技术是可行的，但存在一定局限性，如可视条带需要大量的DNA，15N-DNA的理想丰度要求大于50%等[33]。Buckley等通过改变基因G+C含量来增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分离强度，为原位追踪利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鉴定了独立生存的固氮微生物，通过分析15N标记DNA的16SrRNA，发现了3组新固氮微生物[34-35]。贾仲君等采用SIP技术示踪农田土壤氨氧化微生物DNA，发现相对于古菌，细菌是土壤硝化过程的主要驱动者[36]。贺纪正等对农田土壤生态系统中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）进行一系列研究，得出二者在根际土壤中的丰度、组成对环境的响应占主导作用[37]，并发现土壤中硝化作用伴随着古菌amoA的基因丰度和多样性变化，进一步证明了氨氧化古菌可同化CO2，属于自养型微生物[38]。Jennifer等结合RNA-SIP和DNA-SIP技术，再次证明AOA可通过两种途径固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到验证，进而强调了AOA在硝化和CO2固定过程中的重要性[39]。Karen等以北美黄松林为研究对象，应用H218O-SIP技术调查土壤中氨氧化微生物的生长与死亡情况，发现人工添加氨可刺激AOB的生长，与此同时AOA的死亡数量增加，而AOB则不受影响[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消减过程时，用13C标记的琥珀酸盐作为电子供体，鉴定了同化琥珀酸盐的微生物，指出大多数N2O消减微生物属于草螺菌属和固氮螺菌属。并证明前者消减速度大于后者，在水稻土N2O的减少过程中发挥重要作用[41]。#p#分页标题#e#   3研究展望   SIP技术能有效降低环境微生物群落分析的复杂度，获得功能微生物的目的基因，已成为原位分离功能微生物的重要手段。随着新一代454高通量测序技术的发展，SIP技术可最大程度地认识不可培养微生物的遗传组成和生命活动，获取其功能基因，优化并人工合成在原位环境中具有高效同化或降解作用的新基因。结合土壤化学等方面知识，共同探讨土壤环境中功能微生物的代谢途径和同化过程，挖掘微生物基因资源，鉴别土壤关键元素循环的微生物驱动机制等，将是未来研究发展的热点和重点。