前言：寻找写作灵感？中文期刊网用心挑选的土壤线虫的多样性，希望能为您的阅读和创作带来灵感，欢迎大家阅读并分享。
土壤线虫是植物根际土壤生物区重要的后生动物，在自然界中数量庞大，种类繁多，且直接参与土壤生态系统的物质循环和能量流动，对有机物的分解、养分转化和能量传递起到关键的作用，是土壤生态系统的重要组成部分。土壤线虫生存能力、繁殖能力和环境适应能力强，且对环境变化敏感，其群落组成能够反映出土壤的理化和生物性状，因此土壤线虫成为评价土壤健康的重要指示生物。目前，人们对自然和半自然生态系统及不同环境条件和管理措施下农田生态系统的土壤线虫群落进行了大量研究[1-3]，揭示了不同土壤条件下土壤线虫的群落特征，并反映出土壤的质量状况。目前，土壤线虫研究多采用线虫形态鉴定法，这使得土壤线虫群落研究只能在线虫科、属和功能群水平上进行[4]，而且形态鉴定法工作量大、费时费力、难以快速分析多个土壤样品的线虫群落特征，这使得土壤线虫研究在物种深度和样品广度方面存在缺陷[5]，限制了土壤线虫研究的发展。随着分子生物学的快速发展，分子生态技术被应用到土壤线虫研究中，为线虫分类鉴定和系统关系的分析提供了一个有效的工具。通过线虫基因序列的比对分析，不仅可对线虫进行准确的分子鉴定和系统发育的研究，而且为线虫姊妹种的鉴定和幼虫的分类提供了可靠的依据，极大地提高了土壤线虫研究的精度和效率。本文对分子生态技术在土壤线虫研究中的应用现状进行综述，以期为土壤线虫的分子生物学研究提供参考。 1分子生态技术在土壤线虫研究中的优势 分子生态学是生态学和分子生物学相互渗透、结合而发展起来的新学科，它依靠分子生物学的理论和技术来分析、解决生态学问题。分子生态技术是分子生态学的研究方法，能够在核酸和蛋白质水平上阐明生命系统与环境系统的相互作用规律，克服了传统生态学技术的局限，具有巨大的优势。在土壤线虫研究中，分子生态的优势主要体现在如下4个方面： 1.1适用于高通量分析 线虫的多个基因可用于分子鉴定，如18SrDNA、ITS和线粒体DNA等。高通量测序技术的应用极大地提高了分子鉴定的效率，这使得宏基因组技术能够用于土壤线虫研究，提高了土壤线虫指示土壤环境质量状况的精度。 1.2能够进行遗传分析 利用同源基因分析物种的同源性比利用形态分析更简单、可靠。多种线虫的基因序列能够用于遗传分析，并构建进化树，确定线虫的进化地位。 1.3便于交流分析 线虫分子分类DNA序列登陆到数据库后，全世界的线虫研究专家可共享、下载数据，进行分析，这将促进土壤线虫研究交流和发展。 1.4在种水平上鉴定线虫种类 DNA序列是内在的遗传特性，是线虫种类的本质特征，因此分子鉴定能够在本质上区分线虫种类，克服了线虫形态鉴定的缺陷。线虫形态鉴定只能在种属水平上进行，且需要在显微镜下观察线虫形态特征，效率低下。而分子鉴定能在种水平鉴定线虫种类，能够快速鉴定土壤样品中的线虫种类，提高了线虫鉴定的精度和丰度。 2分子生态技术在土壤线虫研究中的应用 2.1分子标记技术 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映，广泛应用于物种分类、遗传图谱构建和目标基因定位等。Vanderknapp等[6]利用随机引物PCR区分了2种亲缘关系较近的食细菌线虫，表明分子标记技术可应用于线虫生态学研究。Yeates等[5]认为分子技术需要反映出某些特定线虫种或功能群的相对数量，而且至少需要3对引物对单条线虫进行标记。随后，多种分子标记技术应用到线虫研究中，如限制性片段长度多态性（RFLP）[7]、随机扩增多态性（RAPD）[8]和扩增片段长度多态性（AFLP）[9]。然而这些方法均具有明显的缺点，如RFLP的PCR扩增片段长度和酶切片段长度太短，仅仅提供有限的信息，因此只能对少量的已知物种进行区分；RAPD和AFLP提供的信息数量较大，片段长度为100bp左右，但仅靠片段差异多态性不能够区鉴定出物种种类。 2.2DGGE技术DGGE技术 能够区分长度相同、但序列差异的DN段。该技术首先应用于微生物群落研究，分析样品中微生物的物种信息和时空变化，并可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。Waite等[10]将该技术应用到线虫群落研究中，揭示出欧洲草坪土壤线虫种群的多样性，但未将DGGE分析结果与线虫形态鉴定结果相比较，也未揭示线虫遗传多样性和物种丰度信息。Foucher等[11]采用PCR方法扩增线虫18SrDNA区域630bp的片段，并利用DGGE分析扩增片段的多样性，以此鉴定线虫种类，该方法快速高效。虽然DGGE技术具有较多的优点，但仅依靠电泳条带不能揭示每个物种的丰度和遗传进化信息，因此不能完全揭示土壤线虫群落特征。 2.3线虫18SrDNA测序技术 18SrDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，序列中既有保守区又有可变区，保守区反映了物种间的亲缘关系，可变区反映出物种间的差异，在系统发育研究中适用于种级以上的阶元分类。内转录间隔区ITS位于核糖体rDNA18S、5.8S和28S之间，属于中度保守区域。18SrDNA和ITS序列测序技术为分子分类中常用的方法。Floyd等[12]依据线虫18SrDNA基因序列划分“分子操作分类单元（MOTU）”，将序列相似度大于99.5%归为同种线虫。Eyualem等[13]利用18SrDNA测序方法将形态鉴定的5种Panagrolaimus线虫重新划分为2个种。Griffiths等[14]采用18SrDNA基因克隆文库的方法分析了2个位点的土壤线虫群落结构，通过BLAST比对和构建进化树来划分线虫类群，揭示出不同类群线虫的比例，研究发现土壤线虫以Hoplolaimidae、Telotylenchidae、Cephalobidae和Prat-ylenchus为主，然而分子方法揭示的Rhabditida和Tylenc-hida比例低于形态学鉴定的结果。除了18SrDNA之外，应用于线虫分子分类的基因还有ITS[15]和线粒体DNA等[16]。但是，该技术构建克隆文库的效率低，难以满足高通量分析。#p#分页标题#e# 2.4宏基因组技术 宏基因组技术以所研究环境中全部微生物遗传物质作为对象，可揭示微生物的物种多样性和基因多样性。随着高通量核酸测序的发展，可直接对宏基因组样品进行测序、分析，因此极大地提高了宏基因组技术的应用范围。Dorotal等[17]将大规模测序技术应用到线虫群落研究中，利用PCR扩增线虫18SrDNA序列，并构建了4个人工宏基因组文库，通过454测序和BLAST比对，成功地分析了宏基因组文库的线虫多样性，但并未获得各线虫类群的比例。随后，Dorotal等[18]利用454测序产生的序列数量分析了宏基因组文库中的各类群线虫的比例，从而解决了线虫群落研究的物种丰度问题。其研究表明宏基因组技术结合454大规模测序能够应用于线虫群落研究，但该方法需要对每个样本文库分别测序，这既浪费了454技术的高通量测序效率（一个454测序反应可以得到超过100万个序列读长，而Dorotal研究中文库包含序列最大数量仅为1.4万个），又增加了研究成本。 2.5BarcodePCR技术 将多个文库或PCR产物混合后大规模测序，能够极大地发挥454测序技术的超高通量优势，避免构建文库的过程，节省了成本并提高了工作效率，在生态群落研究中可发挥重大作用。Thomas等[19]利用454测序技术对11个扩增于基因组不同区域的PCR混合产物进行高通量测序，并依据原始模版的序列特异性对序列进行归类。这种方法开创了混合PCR产物高通量测序的先河，但随着混合PCR产物数量的增加，仅依据模版序列特异性对序列归类变得更加困难，且难以对序列同源且来源不同的PCR产物进行归类。随后，Jonas等[20]采用BarcodePCR方法，即在PCR引物的5’末端添加一段区分不同样本的短核苷酸序列作为测序后判定序列样品来源的标记，对12个物种的线粒体DNA18S区域进行扩增，454测序PCR混合产物，然后利用特异性Barcode对PCR序列归类，从而开启了多样本的生物群落研究。理论上，利用454测序技术一次反应可完成600个PCR混合产物的测序，能够实现高通量分析。目前，BarcodePCR结合454测序技术在微生物群落研究中广泛应用，揭示了人体和动物肠道菌群、海洋微生物菌群[21-22]和植物病毒群体多样性[23]，极大地促进了微生物生态学的发展。但是，该技术还未应用在土壤线虫群落研究中，因此，建立土壤线虫群落研究的BarcodePCR技术体系，有助于解决土壤线虫研究中难以高通量分析的问题。土壤线虫BarcodePCR技术需要解决2个关键问题：（1）筛选适合454测序单反应长度的线虫分子分类标记基因。目前，454测序技术单反应长度平均为450bp，因此，标记基因的长度应小于450bp。以线虫18SrDNA基因全长序列为目标，从中选择具有一定保守性和变异性的区域，并截取长度略小于450bp的序列作为线虫分子分类标记基因，确保读长序列双末端包含完整的分子标签，便于后续对序列归类。（2）引物两端添加的分子标签对扩增效率无明显的影响。分子标签添加于引物5’末端，可能会对PCR的扩增效率有一定影响，造成结果误差。因此，需要评价分子标签对PCR扩增效率的影响，淘汰对扩增效率起明显抑制或促进作用的分子标签引物，保留对扩增效率无明显影响的分子标签引物，提高结果的准确性。 2.6线虫序列数据库 DNA测序和序列数据库为分析物种的遗传进化关系、开发物种分类的特异性引物或基因探针提供了极大的便利。DNA序列数据库包含海量的序列数据，如GenBank、EMBL-Bank（EuropeanMolecularBiologyLabor-atory）、DDBJ（DNADatabaseofJapan）、NEMBASE和WORMBASE等，这些序列涉及160000个物种，包括细菌、真菌、原生动物、线虫和其他动物。目前DNA数据库中的线虫序列数据主要用于植物寄生线虫和可培养的线虫分类研究[24]。最近建立的线虫数据库还包括线虫的形态和分类数据，这有助于对自由生活线虫的研究。Nematol中包括大量的线虫图片、进化树和序列，而Nemys中包含大量的线虫分类资料。这些序列和资料为线虫分子分类奠定基础，可为从种水平上分析线虫多样性提供依据。 3前景与展望 分子生态技术的引入，极大地拓展了土壤线虫研究的广度和深度。高通量测序技术的发展，使得同时对多个土样样品的土壤线虫多样性进行大规模分析成为现实，从而对不同类型、不同生态区域的土壤线虫多样性进行比较分析，同时可大规模分析土壤微生物与土壤线虫的互作关系，从而在土壤生态系统的角度分析土壤线虫的种群动态变化，更好地发挥土壤线虫的生物指示作用。生态基因组技术以高通量测序为基础，以生物信息学为手段，从基因组或宏基因组角度揭示生态群落的结构功能[25]，生态基因组学将是土壤线虫生态学的发展方向之一，而土壤线虫群落研究是土壤线虫生态学的重点。因此，从生态基因组学角度，高通量分析土壤线虫群落结构，解析土壤线虫的动态变化，能够从广度、深度上揭示土壤线虫的生态功能，使土壤线虫研究更加深入。
