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作者：朱天辉 单位：四川农业大学
本实验在2个方面体现创新设计:(1)走出课堂，面向林业生产实际。从生产中发现问题，获取的实验材料，更具针对性，理论与实践紧密结合，增强了学生的兴趣和参与意识。(2)实验材料多样性，根据农林高校生源多来自农村、学生获取植物材料较容易的特点，每小组采集的材料来自不同生态区域，实验结果丰富多样，学生组别间可相互学到更多的知识，提高了学习效率。
实验学时与安排
本实验具有季节性、综合性和持续性的特点，选择在春季5～7月，实验总学时15学时，分5次进行，每次教学指导20min，采用小结实验进度和答疑方式。学生查阅资料、编制方案及实验报告不计入学时，根据报告内容和新颖性推荐发表。
实验方法
1样品采集与前处理学生实验前按5人1组分组，通过社会实践或生源地了解林木病害发生情况，实地采集或邮寄林木病害分离用标本，并填写好“林木病害调查记载卡(见图1)”。记载卡记录病害发生的生态环境因子、林地管理情况，对分析发病原因至关重要。采集标本注上标记后，如不能及时分离，要用塑料袋分类装好，冰箱中低温保存备用以防样品变质。
2培养基制作培养不同的病原菌，要根据它们的需求配制适宜的培养基，对营养有特殊要求的病原菌还要配制特定的选择性培养基。培养基的种类很多，截至1930年，已经报道了将近2500种。学生要对所诊断的病害性质有一基本了解，如真菌病害或细菌病害，选择适宜培养基制作。因此，同学们在实验设计时应选择马铃薯葡萄糖琼胶培养基分离真菌或肉汁冻培养基分离细菌。由于该步骤要加热和高压蒸汽灭菌，有一定危险性，除安全教育外，还要求学生不能在灭菌期间离开实验室。马铃薯葡萄糖琼胶培养基制作时，先将洗净后去皮的马铃薯200g切碎，加水1000ml煮沸0.5h，用纱布滤去马铃薯，再加水补足1000ml;然后加葡萄糖或蔗糖10～20g和琼胶17～20g，加热使琼胶完全熔化后，趁热用纱布或脱脂棉过滤，或者用滤纸和保温漏斗过滤。而后分装试管，加棉花塞后灭菌。作平板培养的每管约10ml，作斜面培养的则每管约5ml。根据工作需要，还可以分装在三角瓶中灭菌。教师必须在实验前说明，高压灭菌器的用法和注意事项:(1)灭菌器中的水，应加水到指定的标度;(2)需要灭菌的器物放在灭菌器内，将盖密闭，打开气门;(3)加热，等空气完全排除后(蒸汽从气门有力地冲出)，关闭气门;(4)当压力上升到所需要的指标后，开始计算灭菌的时间，灭菌过程中保持压力不变;(5)达到需要灭菌的时间，停止加热，稍微打开气门，排出蒸汽使压力慢慢下降;(6)当压力降到内外相等时，才能打开高压灭菌器的盖。肉汁冻培养基的方法:取3g牛肉浸膏，蛋白胨5～10g，琼胶17～20g，水1000ml，与马铃薯葡萄糖琼胶培养基的方法相同，这里不再赘述。
3分离培养(1)超净工作台清毒与分离材料的选择。分离和培养应该在很清洁的条件下进行。打开超净工作台紫外灯灭菌30min，杀死空气中的微生物，关灯5～10min，再进行分离。(2)组织分离法分离真菌。病原真菌的分离一般都是用组织分离法［3］，是林学、森保专业学生必须掌握的技术。要求学生从上述采集的标本中，选择新近发病的植株、器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。腐生菌容易在生病很久而已经枯死或败坏的部分滋生，所以一般斑点病害应该从邻近健全的组织的部分分离。在超净工作台上，从病斑切取每边约5mm的小块病组织，用70的酒精浸几秒钟，再在0.1的酸性升汞水溶液中浸3～5min;而后用灭菌水换洗3次，将其移置在上述马铃薯葡萄糖琼胶培养基平板上培养。用蜡笔在培养皿上注明分离材料日期后送入25℃温箱反转培养皿培养;3～5d，在培养基上选择纯的菌落，移植到新的平面上或斜面上培养并纯化，并计算各分离真菌百分率。以优势菌群作为回接实验菌种。(3)平板划线分离法分离细菌。平板划线法［3］是分离细菌的常见方法，取小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过2次以后，放在灭菌载玻片上的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎。静置一定时间，用灭菌的移植环蘸取以上组织液在肉汁冻培养基琼胶平板上划线培养;先在平板的一侧顺序划3～5条线，再将培养皿转60°，将移植环灭菌后，从第2条线末端，顺序划出3～5条线。也有其他划线的形式，如4分划线和放射划线等，目的都是使细菌分开形成分散的菌落，并计算各分离细菌百分率，以优势菌群作为回接实验菌种。
4病原回接与再分离病害的种类很多，其传染方式也各不相同，因此要用相应的接种方法。种子、土壤、气流和昆虫等传染的病害，接种方法是不同的。因此，指导老师要求学生在进行试验前，对一种病害在自然条件下的传染方式和侵染途径有所了解。一般气流和雨水传播病害较普遍，可采用喷雾法进行。将上述真菌孢子(或菌丝)悬浮液喷洒在寄主表面，并用湿纱布保湿3d，病菌可以从气孔、伤口或表皮直接侵入。影响接种试验的因子包括病原物的致病性和致病力、接种植物的抗病性和感病性和发病的环境条件。在接种时，应尽量模仿接种菌在自然条件下，侵染寄主时的环境条件，特别要注意温度和湿度对接种发病的影响。学生在回接后，每隔2～3d观察病害发生情况并与自然状态比较，等出现显著症状后按上述方法能再次分离到用来回接的病原，否则实验失败。
5病原鉴定与病因分析(1)病原真菌:以形态学特征［4］为主，结合分子生物学［5］鉴定种群。(2)病原细菌:形态、生理生化结合分子生物学［6］鉴定种群。实验要求学生根据优势菌群、回接试验情况与采样地环境状态分析发病因素，写出实验报告，并进行课程讨论。
6创新实验设计小结本创新实验流程简单总结为:在采样及前处理基础上，完成“分离、接种、再分离”的技术规程。(1)分离:从病组织上分离病原物并进行纯培养;(2)接种:用纯培养物接种到相同的健康植物上，给予适宜发病条件，观察是否引起原来相同的病害;(3)再分离:从接种后发病的植物上，能分离到与用来接种的病原物。
结束语
实验设计15学时，分5阶段完成，占森林保护系列实验近一半学时，实验综合运用《林木病理学》、《林木病害研究方法》、《微生物学》、《分子生物学技术》等课程内容，属于我校综合型实验、探索型实验、研究型实验的代表，是理论基础与面向林业生产相结合的有效形式，这种创新实验方式应是高等农业院校教学实践［7－8］的发展方向。通过该实验同学们在实施前主动利用课余、假期社会实践活动，了解生产中亟待解决的林木病害问题，为实验设计开展前期工作，目的性、针对性强。本实验已实施5年，涉及林学、园林及观园专业学生。目前有30名学生的实验报告作为林木病害诊断书提供给了地方林业部门作为制定防治方案的决策依据，有15名学生的实验论文已正式发表。学生在实验报告和课程讨论中总结到:“人工诱发诊断技术是学好《森林保护系列实验》和《林木病理学》课程的综合体现，通过实验，不仅提高了自己的实践操作能力，而且解决了一些生产的实际问题，很有成就感”。作为指导实验的教师在丰富了教学内容的同时，获得了更多科学研究素材，实现了学与教的双赢。#p#分页标题#e#