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目前对采用人工接种发酵生产桑叶茶及其对其中DNJ、黄酮、多糖、多酚等主要功能成分含量影响的研究鲜有报道。本文分别以4种菌单独或组合发酵桑叶制得的桑叶茶，分析其中DNJ、黄酮、多糖、多酚4种功能成分含量变化，为桑叶的深度开发利用提供数据。
材料与方法
1.实验材料
1）实验菌种：黑曲霉(AsPergillusniger)，GSICC60108，甘肃省微生物菌种保藏中心；日本根霉(RhizopusjaponicusVuillemin)，GIM3.119，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；绿色木霉(Trichodermaviride)，GIM3.443，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；青霉(Penicillium)，GSICC61603，甘肃省微生物菌种保藏中心。以上四种菌种的安全等级均高，其生物危害程度为四类，在通常情况下不会引起人类或者动物疾病。
2）实验样本：自然发酵桑叶茶、人工发酵桑叶茶由本实验室自制。
2.试剂与仪器
1）主要试剂：DNJ标准品，北京德威钠生物技术有限公司；甘氨酸（Gly），sigma公司；9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl），sigma公司；乙腈为色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；没食子酸标准品，中国药品生物制品检定所；芦丁标准品，北京德威钠生物技术有限公司；其他常用试剂均为分析纯。
2）主要实验仪器：Waters1525HPLC，美国Waters公司；5810型台式高速离心机，德国Eppendorf公司；Spectrumlab22可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
3.实验方法
1）发酵桑叶茶的制备：采摘从顶芽往下数4-10片的新鲜桑叶，去柄，切为4cm×4cm的小叶片，混匀后称取100g叶片用微波杀青90s，揉捻，加入107cfu菌液10mL(自然发酵只加10mL无菌水)，复揉，28℃发酵5h，微波干燥，制得桑叶茶。（注：加菌量共为107cfu，菌种复配比例为1:1或1:1:1。）2）DNJ的测定测试样品的制备：取桑叶茶粉末0.5g，加入一定量超纯水，80℃水浴浸提2h(每20min摇匀一次)，抽滤后，滤渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超纯水定容至50mL，即得样品提取液。DNJ的衍生化及测定方法按照参考文献[19]进行。色谱条件：色谱柱：C18柱（150mm×4.6×5μm）；流动相：乙腈-0.1%醋酸(50:50，V/V)；流速：1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL；紫外检测器，检测波长254nm。3）黄酮测定：取桑叶茶粉末0.5g于50mL离心管中，加70%乙醇15mL，80℃水浴80%功率超声提取15min，7000r/min离心5min，抽滤，得到滤液。如此共提取3次，滤液用70%的乙醇定容至50mL。吸取1.0mL滤液，用AlCl3比色法[20]测定4）多糖测定：取桑叶茶粉末0.250g于兰盖瓶中，加入20mL沸蒸馏水，在100%功率下55℃超声提取20min，将提取液过滤后定容至25mL。取1.0mL滤液用苯酚-硫酸法[21]测定多糖含量。5）多酚测定：按照GB/T8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[22]进行测定。
4.数据统计与分析：各实验至少重复3次以上，实验数据用Excel和Spss16进行统计处理。
结果和讨论
按照3.2）的实验方法，对不同浓度DNJ标准溶液进行测定，得到DNJ的标准曲线线性回归方程为y=15776x-70392，相关系数r=0.9996。式中x为DNJ浓度，μg/mL；y为峰面积。按照1.3.3实验方法，测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度，得到芦丁标准曲线线性回归方程为y=11.622x-0.0031，相关系数r=0.9997。式中，x为芦丁浓度，μg/mL；y为吸光度。按照1.3.4的实验方法，测定不同浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，得到葡萄糖的标准曲线线性回归方程为y=10.909x-0.0021，相关系数r=0.9998。式中，x为葡糖糖的浓度，μg/mL；y为吸光度。按照1.3.5的实验方法，测定不同浓度没食子酸标准溶液的吸光度，得到没食子酸的标准曲线线性回归方程为y=0.0208x+0.0034，相关系数r=0.9998。式中，x为没食子酸的浓度，μg/mL；y为吸光度。实验结果表明，各标准曲线的相关系数均大于0.9990，线性关系良好，可用于样品中相关活性成分的测定。
2.DNJ标准品和样品的色谱图
将DNJ经衍生化后上高效液相色谱仪进行测定，得到如图1、图2、图3所示色谱图：由色谱图2可知，在本实验条件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留时间为2.731min，与Gly-FMOC和FMOC-OH的峰间距分别相差2.719min和4.243min，表明这两种物质均不干扰DNJ的测定。
3.单一菌种发酵桑叶茶中DNJ等活性成分含量变化
分别以黑曲霉、日本根霉、绿色木霉和青霉的单一接种于桑叶中进行发酵生产桑叶茶，与自然发酵生产的桑叶茶比较其DNJ等活性成分含量的变化。实验结果如表1：从表1可知，用绿色木霉发酵所得桑叶茶中DNJ含量为111.28mg/100g.干重，与自然发酵得到的桑叶茶比较，下降了6.43%，且有显著性差异（P＜0.05）；而日本根酶、黑曲霉、靑霉发酵后得到的桑叶茶中DNJ含量均上升，特别是日本根酶发酵后DNJ含量为131.56mg/100g.干重，与自然发酵的桑叶茶比较增加10.63%，具有极显著差异（P＜0.01）。与自然发酵比较，4种单一菌种发酵桑叶茶中多糖含量均下降，其中黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中多糖含量与自然发酵的比较分别下降了14.48%、8.84%、9.18%，均具有极显著性差异（P＜0.01）；而日本根霉发酵桑叶茶中多糖仅下降了2.67%，无显著性差异（P＞0.05）。与自然发酵比较，用日本根霉发酵桑叶茶中黄酮增加了5.78%，有极显著性差异（P＜0.01）；而黑曲霉、青霉、绿色木霉3种菌发酵桑叶茶中黄酮含量分别降低了23.77%、0.86%、14.73%，其中黑曲霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中黄酮下降有极显著差异（P＜0.01）；而靑霉发酵后黄酮含量下降无显著性差异（P＞0.05）。与自然发酵比较，用日本根霉、黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵桑叶茶中的多酚含量分别降低了9.00%、33.56%、11.74%、24.56%，其中日本根霉发酵桑叶茶中多酚含量下降相对较少，但也有显著性差异（P＜0.05），而黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中多酚含量下降有极显著性差异（P＜0.01）。综合单一菌种发酵实验的结果可知，与自然发酵比较，采用日本根霉发酵后所得桑叶茶中DNJ、黄酮含量有极显著增加；而多糖、多酚含量虽然有所下降，但比实验的其他菌种发酵后桑叶茶中这两种成分的下降低很多。因此，从对发酵桑叶茶功能成分影响来看，单一菌种发酵以日本根酶较好。#p#分页标题#e#
4.菌种两两混合发酵桑叶茶对DNJ等功能成分含量的影响
分别将黑曲霉、日本根霉、绿色木霉和青霉两两混合接种于桑叶中进行发酵生产桑叶茶，与自然发酵生产的桑叶茶比较DNJ等功能成分含量的变化。实验结果如表2：从表2可知，用日本根酶+绿色木霉、青霉+绿色木霉、黑曲霉+绿色木霉、黑曲霉+青霉混合发酵的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵比较均有一定增加，但无显著性差异（P＞0.05）；而经日本根酶+青霉、日本根酶+黑曲霉发酵的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵比较有轻微降低，但无显著性差异（P＞0.05）。而由日本根酶、黑曲霉、靑霉单独发酵生产的桑叶茶中DNJ含量均上升，而将它们两两混合后发酵生产的桑叶茶中DNJ含量却无此变化。表明这些菌种两两混合发酵对桑叶茶DNJ增加并无协同作用，反而可能具有一定的拮抗作用。从表2可知，黑曲霉+绿色木霉发酵的桑叶茶中多糖含量与自然发酵相比增加了0.57%，日本根霉+黑曲霉发酵的下降了1.21%，但差异无显著性（P＞0.05）；日本根霉+绿色木霉、青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉、黑曲霉+青霉发酵的桑叶茶多糖含量分别下降了8.93%、8.84%、8.46%、5.09%，有极显著性差异（P＜0.01）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多糖含量仅日本根霉发酵的与自然发酵比较下降差异无显著性，而其他3种菌发酵的桑叶茶多糖含量下降均具有极显著性差异。表明这4种菌两两混合后发酵生产桑叶茶与单独接种一样，会导致其中多糖含量下降。由表2可知，经日本根霉+绿色木霉、黑曲霉+青霉发酵桑叶茶中黄酮含量与自然发酵比较分别下降7.51%和9.22%，有极显著性差异（P＜0.01）；青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉、黑曲霉+绿色木霉、日本根霉+黑曲霉发酵后桑叶茶中黄酮含量与自然发酵比较分别增加了5.00%、3.11%、0.12%、2.41%，除青霉+绿色木霉发酵的增加有显著性差异（P＜0.05）外，其他发酵的差异不显著。而当用4种菌单独发酵的桑叶茶中，除日本根霉发酵的桑叶茶中黄酮明显增加外，其余3种菌发酵的桑叶茶中黄酮含量均下降。实验结果表明，这4种菌两两混合发酵对桑叶茶中黄酮含量有下降的作用。由表2可知，用青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉发酵后的桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较分别增加了6.87%、9.06%，均有显著性差异（P＜0.05）；日本根霉+绿色木霉、黑曲霉+绿色木霉、黑曲霉+青霉、日本根霉+黑曲霉发酵桑叶茶中多酚含量分别降低了9.08%、15.19%、15.57%、13.12%，均具有显著性差异（P＜0.05）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较均降低，其中日本根霉发酵的下降相对较少。实验结果表明，如用青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉两两混合发酵对桑叶茶中多酚含量的增加有一定的协同作用。
5.种菌种混合发酵桑叶茶对DNJ等功能成分含量变化
分别将黑曲霉、日本根霉、绿色木霉和青霉按1:1:1的比例混合接种于桑叶中进行发酵生产桑叶茶，与自然发酵生产的桑叶茶比较其中DNJ等功能成分含量的变化。实验结果如表3：将黑曲霉+绿色木霉+青霉、绿色木霉+日本根酶+青霉、黑曲霉+绿色木霉+日本根霉、黑曲霉+日本根酶+青霉分别命名为A、B、C、D。可知，经A、B、C,3种菌种混合发酵生产的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵得到的桑叶茶比较，分别增加了4.41%、5.20%、8.10%，其中经C混合发酵得到的桑叶茶中DNJ与自然发酵的比较具有显著性差异（P＜0.05）；而D发酵得到的桑叶茶中DNJ含量与自然发酵的比较降低了5.79%，但无显著性差异（P＞0.05）。而当用日本根酶、黑曲霉、靑霉发酵生产的桑叶茶中DNJ含量均上升，而将它们三种菌混合发酵生产的桑叶茶中DNJ含量虽有增加，但不如单独接种日本根霉增加的多，进一步证明它们混合发酵对桑叶茶中DNJ增加的影响无协同效应，而是可能具有拮抗作用。
从表3可知，用黑A、B、C、D发酵的桑叶茶中多糖含量与自然发酵比较分别降低了7.16%、13.96%、10.99%、9.41%，差异具有极显著性（P＜0.01）或显著性（P＜0.05）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多糖含量仅日本根霉发酵的与自然发酵比较下降差异无显著性，而其他3种菌发酵的桑叶茶多糖含量下降均具有极显著性差异。表明这4种菌三三混合后发酵生产桑叶茶与单独接种一样，会导致其中多糖含量下降，而且它们的这种降低作用可能具有协同性。经A、B、C、D发酵桑叶茶中黄酮含量与自然发酵比较分别下降了为2.34%、8.41%、16.86%、9.30%，除A外，差异均有极显著性（P＜0.01）。而当用4种菌单独发酵得到的桑叶茶中，日本根霉发酵的桑叶茶中黄酮明显增加，其余3种菌发酵的桑叶茶中黄酮含量均下降。表明，这4种菌三三混合发酵对桑叶茶中黄酮含量可能具有协同的下降作用。经A、B、C、D发酵后桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较分别降低了13.31%、12.52%、23.92%、7.67%，均有极显著性差异（P＜0.01）。而用4种菌单独发酵的桑叶茶中多酚含量与自然发酵比较也是降低的，其中日本根霉发酵的下降相对较少。表明，用4种菌单独或三三混合发酵都将导致生产的桑叶茶中多酚含量下降。
结论
1.与自然发酵比较，单独接种这4种菌发酵生产桑叶茶中以接种日本根酶可使其中DNJ含量达到0.133g%，比自然发酵的增加10.63%；而将4种菌两两混合发酵而生产的桑叶茶中DNJ含量无影响；而将黑曲霉+绿色木霉+青霉、绿色木霉+日本根酶+青霉、黑曲霉+日本根酶+青霉3种菌种混合发酵生产的桑叶茶中DNJ含量比自然发酵的有一定增加，但增加得不如日本根霉发酵的多。
2.与自然发酵比较，单独接种4种菌发酵生产桑叶茶中，除接种日本根霉生产的桑叶茶多糖含量无明显变化外，其余3种菌均使发酵桑叶茶多糖含量下降；将4种菌两两混合接种发酵生产的桑叶茶中，只有黑曲霉+绿色木霉和日本根霉+黑曲霉发酵的桑叶茶中多糖含量未受到影响，其余的菌种两两混合发酵都使桑叶茶中多糖含量下降；而将4种菌三三混合发酵均可使生产的桑叶茶中多糖含量明显下降。
3.与自然发酵比较，单独接种4种菌发酵生产桑叶茶中，除用日本根霉发酵桑叶茶中黄酮增加了5.78%，靑霉发酵对其中黄酮含量无影响外，另2种菌均使发酵桑叶茶中黄酮含量降低；将4种菌两两混合发酵生产桑叶茶，除青霉+绿色木霉发酵的可使黄酮含量增加5.00%外，其余的对发酵桑叶茶中黄酮含量无影响或使其下降；将4种菌三三混合发酵生产桑叶茶，除黑曲霉+绿色木霉+青霉对其中黄酮含量无影响外，其余的均使桑叶茶中黄酮含量下降。#p#分页标题#e#
4.与自然发酵比较，单独接种4种菌发酵生产桑叶茶可使其中多酚含量下降，其中日本根霉发酵桑叶茶中多酚含量下降9.00%，相对相对较少；将4种菌两两混合发酵生产桑叶茶，除青霉+绿色木霉、日本根霉+青霉发酵后的桑叶茶中多酚含量增加，其中日本根霉+青霉发酵的增加9.06%，较多，其余的使发酵桑叶茶中多酚含量降低；将4种菌三三混合发酵生产的桑叶茶中多酚含量均明显下降。
通过对上述研究结果的分析发现，用日本根酶单独发酵得到的桑叶茶中DNJ与自然发酵比较增加了10.63%，多糖含量未受到影响，黄酮含量增加了5.78%，多酚含量下降了9.00%，但与其他菌发酵的比较下降是最少的；经黑曲霉发酵后黄酮、多糖、多酚含量均分别下降了23.77%、14.48%、33.56%，是下降最高的。DNJ是桑叶茶中最主要的功能性成分。因此，认为日本根霉是在所用的实验菌种中保证发酵桑叶茶功能性质最好的菌种。
我们在以后的研究工作中，在保证桑叶茶安全性的前提下，还将进一步筛选其他的微生物与日本根霉共同作用，期望能进一步提高DNJ等功能成分含量，使发酵桑叶茶成为人们喜爱的、有明显保健作用的饮品。（本文图、表略）
本文作者：肖洪 沈以红 黄先智 丁晓雯 张亚琼 梁菡峪 张迪 单位：西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室 重庆家蚕基因组生物学国家重点实验室 重庆西南大学蚕学与生物系统研究所