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作者：杜林 李莲 单位：仲恺农业工程学院轻工食品学院 中山大学生命科学院
我们的初步研究表明，线粒体产生的活性氧和甲酸诱导的酵母细胞死亡关系密切［9］。因此，我们推测，降低酵母菌线粒体活性，抑制活性氧的产生，可以增强酿酒酵母对甲酸的抗性。仪器与设备恒温摇床(哈尔滨东明仪器HZQ－C);培养箱(Thermo);流式细胞仪(VantageSE，BDBiosci-ences)。酵母菌菌株、质粒及培养基酿酒酵母BY4741由美国Rochester大学的Da-vidGoldfarb教授惠赠。酿酒酵母W303－1a野生型菌株由中山大学微生物遗传实验室提供，W303－1a背景ATP酶4亚基基因缺失株由中山大学微生物遗传实验室构建。YPD液体培养基:2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%D－(+)－葡萄糖，分装后121℃高压灭菌20min。
酵母细胞的培养及甲酸处理后的酵母细胞存活率测定取对数期酿酒酵母细胞培养液0.5mL，接种至装于250mL三角瓶中的50mLYPD液体培养基中，置于30℃，200r/min往复式振荡培养箱培养细胞至对数期或稳定期，分别取1mL菌液于1mL离心管中，立即加入相应摩尔浓度的甲酸，30℃处理40min后，在YPD培养基上以标准平板计数法计数，每一稀释度涂3个平板，以3次独立的实验结果计算存活率。
细胞内活性氧爆发的流式细胞仪检测细胞质中活性氧检测:取5mLYPD加入试管中，接入50μL过夜培养的酵母菌液，摇床培养6h(30℃，200r/min)。吸取以DMSO为溶剂的10mmol/L双乙酸二氯荧光黄(dichlorofluoresceindiace-tate，DCFH-DA)溶液2μmol/L，使染色时DCFH-DA的工作浓度为20μmol/L，避光孵育15min，使DCFH-DA充分进入细胞。根据需要，迅速加入一定量的1mol/L甲酸，室温或培养箱恒温避光处理，根据实验要求，分别吸取100μL处理中的各样品菌液加入FACS管中，加入900μL冷藏的PBS，立即以流式细胞仪上样分析。所用氩离子激光器激光波长为488nm，在530nm检测激发出的荧光，以流式细胞仪FL－1通道进行检测。或加入PI后以FL－1和FL－2通道检测。超氧阴离子的检测:先以无菌DMSO配置10mmol/L的超氧化物阴离子荧光探针二氢溴化乙锭(Dihydroethidium，DHE)溶液，取0.5μL加于1mL菌液，使DHE的终浓度为5μmmol/L，30℃避光孵育15min，加入相应浓度甲酸避光处理，以流式细胞仪FL-2通道进行分析。激发光波长为535nm，发射光波长为610nm。
甲酸处理导致线粒体超氧阴离子的产生与自由基的扩散为了了解活性氧爆发时细胞内超氧阴离子及细胞质内过氧化氢等活性氧的水平，故使用活性氧荧光探针DCFH-DA和DHE同
时对甲酸处理时细胞中的活性氧进行检测。由图1可见，在用甲酸处理10min时，以荧光探针DCFH-DA和DHE依次检测到活性氧的产生。细胞内DHE阳性率超过DCFH-DA的阳性率，显示DHE氧化后的荧光先产生。这和两种荧光染料的特性有关，DHE可检测线粒体产生的超氧阴离子，DCFH-DA可反映细胞质中的活性氧水平。线粒体电子传递链障碍导致活性氧产生时，超氧阴离子首先产生。所以实验中首先检测到较多的细胞产生了超氧阴离子，而此时以DCFH-DA检测到的细胞质活性氧阳性的细胞却比超氧阴离子阳性的细胞少，说明细胞质内的活性氧是由线粒体内超氧阴离子扩散形成。
还原剂预处理对活性氧爆发及存活率的影响N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，是细胞内还原性谷胱甘肽的前体，因为能够快速穿过细胞膜，因此是一种细胞生物学研究中广泛使用的还原剂。NAC可在细胞内形成含巯基的代谢产物，促进GSH的合成，消除自由基。在用甲酸处理酵母细胞，使其细胞内活性氧爆发前我们先用NAC预处理细胞，使其细胞内NAC达到较高浓度以抑制活性氧的水平，检测抑制活性氧对细胞存活率的影响。由图2可见，和对照相比，2mmol/L的NAC预处理明显降低了死亡率，说明细胞内还原剂的增加，活性氧的抑制可降低甲酸处理后细胞的死亡率。有可能是由于NAC减少了活性氧，从而抑制了活性氧对酵母细胞的损伤。另外，使用PI染色后流式细胞仪分析细胞膜完整性的方法也证明NAC预处理可以降低甲酸处理后的酵母细胞死亡率。
酿酒酵母线粒体活性对甲酸处理下细胞存活率的影响在病理和生理条件下，通常线粒体都是活性氧的主要来源。线粒体电子传递链的障碍，往往导致活性氧的大量形成。而在不同遗传性状的酿酒酵母细胞中，或同一种细胞处在不同的生长条件下，其线粒体活性往往有很大差异［10］。因此我们对不同类型酿酒酵母细胞中活性氧的爆发及细胞死亡情况进行了研究。
酵母细胞菌龄对甲酸处理时细胞死亡率的影响和稳定期细胞相比，对数期的酵母细胞代谢更为旺盛，其线粒体活性更高，因此我们推测同浓度甲酸在对数期酵母细胞中能导致更猛烈的活性氧爆发，从而对细胞造成更大的破坏，因此用甲酸处理培养24h的稳定期细胞时活性氧产生情况，并比较培养6h的对数期细胞和培养24h的稳定期细胞在同浓度甲酸处理时的存活率。由图3可见，对数期细胞对甲酸的敏感程度比稳定期细胞高得多，这在甲酸浓度较高时更为明显。故甲酸的毒性和酵母细胞的代谢状态密切相关。因此可以认为，对数期细胞由于处于代谢旺盛的特点，其细胞内较高活性的线粒体在甲酸处理下产生更多的活性氧，从而导致更多的对数期细胞死亡。
低温预处理对甲酸诱导的细胞死亡率的影响由于线粒体的产能速度和微生物细胞外环境密切相关，即细胞外因素会影响线粒体活性，因此我们推测低温预处理降低线粒体活性后，再以甲酸处理细胞，这时线粒体活性氧爆发应该减弱，细胞的死亡率应该下降。故在加入甲酸之前，先将细胞置于4℃10min，再将其和正常培养的对照样品同时加入甲酸处理40min，然后以标准平板计数法比较二者的存活率。在本实验中，我们还对另一实验室研究常用的酿酒酵母BY4741进行了测定。由图4可见，短时间的低温预处理，即可明显提高甲酸处理后的细胞存活率。该结果也表明，甲酸诱导细胞死亡和细胞的代谢状态有关。
线粒体呼吸缺陷对甲酸处理细胞存活率的影响ATP酶结构上的缺陷会影响其合成ATP的能力及线粒体的整体活性。所以我们通过敲除ATP酶亚基基因的方法，降低线粒体的活性，以期减弱甲酸诱导的活性氧的爆发并提高细胞存活率，并采用标准平板计数法对同浓度甲酸处理后野生型和ATP酶4亚基缺失株的存活率进行了比较。由图5可见，线粒体缺陷会大大提高细胞的存活率，分析其原因，推测是在线粒体活性较低的情况下，甲酸诱导其产生的活性氧较少，故活性氧对细胞的破坏较小，所以细胞的存活率明显上升。此外，我们还发现位于线粒体外膜的AIF基因缺失后，其线粒体膜电位会下降，同时细胞对甲酸的抗性也会增强(数据未列出)。#p#分页标题#e#
与讨论活性氧是指一些能和还原性物质反应的含氧化合物。正常生理情况下，超氧阴离子的生成由NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶参与，也可由线粒体内电子传递链中的半醌类化合物参与［11］，是线粒体内形成的第一种活性氧。由于甲酸可以阻断呼吸链，因此可以导致超氧阴离子的形成。超氧阴离子在线粒体内产生后，可以在线粒体内部或细胞质内转化成过氧化氢，因而在实验中可以用DCFH-DA检出较高比例的活性氧阳性细胞。在谷胱甘肽大量消耗的情况下，过氧化氢可破坏细胞成分，或进一步转化成氧化性更强的羟自由基，对核酸等结构产生致命的破坏。正常细胞会产生少量的活性氧，而一些细胞强毒性试剂如抑制细胞色素氧化酶的砷化物、氰化物可导致活性氧的快速大量产生。本文研究表明，甲酸处理会使细胞迅速产生超氧阴离子，并进一步转化为细胞质中其他类型的活性氧。和稳定期的细胞相比，对数期酿酒酵母细胞对甲酸更为敏感，死亡率更高;还原剂NAC短时间预处理，较低温度预处理，敲除ATP酶的4亚基均可以降低细胞的死亡率。因此，降低甲酸处理下线粒体产生活性氧的能力可增强酿酒酵母细胞对甲酸的抗性。因此，在深入研究甲酸毒性机理和抗性机制的基础上，利用分子生物学方法，改变酿酒酵母细胞内甲酸作用的靶位点或生化过程，构建线粒体呼吸链或其他线粒体膜蛋白的突变株，可获得具有较强甲酸抗性的菌株。