前言：寻找写作灵感？中文期刊网用心挑选的GSH工业化菌株的选育新途径，希望能为您的阅读和创作带来灵感，欢迎大家阅读并分享。
作者：陈叶福 李军侠 沈世超 吕鸿雁 肖冬光 单位：工业发酵微生物教育部重点实验室 天津科技大学生物工程学院
培养基（1）YEPD培养基（斜面培养及平板纯化用）：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，琼脂20g/L，pH6.0，0.1MPa灭菌15min。（2）种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH6.0，0.1MPa灭菌15min。（3）gsh发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母粉7g/L，KH2PO41g/L，K2HPO4•3H2O2.5g/L，MgSO40.1g/L，pH值自然，0.1MPa灭菌15min。
培养方法种子培养从活化后的斜面上挑取一环接入种子培养基中，30℃静置培养24h。GSH发酵种子液以10%的接种量，接入发酵培养基（装液量50mL/250mL三角瓶）中，28℃、160r/min摇瓶培养22h。
镉盐抗性筛选向融化后的YEPD固体培养基中加入不同体积0.5mol/L的镉盐母液，制成含有不同镉盐浓度的梯度平板。将酵母菌株划线于梯度平板上，30℃培养3d～4d，观察菌落生长情况。紫外诱变育种参照参考文献[6]。谷胱甘肽提取热水抽提法[7]。谷胱甘肽生成量测定ALLOXAN试剂衍生法[8]。
正突变株与正突变将GSH产量或GSH胞内含量较原株有显著提高（提高幅度大于5%）的突变株定义为正突变株，相应的突变为正突变。2结果与分析2.1发酵过程中添加镉盐对酿酒酵母产GSH的影响据文献报道[9]，酿酒酵母发酵产谷胱甘肽（GSH）过程中添加微量镉盐可以提高GSH生成量。由于镉离子对菌体生长具有很强的毒害作用，因此，必须确定镉盐添加的时间和浓度，以消除镉盐对菌体生长的影响，这样才能准确考察镉盐对菌体GSH生成量的影响。
发酵过程中添加镉盐时间的确定绘得酿酒酵母B-3发酵生长曲线见图1，发酵第3h进入对数生长期；第8h～11h，菌体生长速度减慢，并缓慢进入生长衰退期。为了减少镉盐对酵母菌体生物量的影响，定于发酵第11h加入适量浓度的镉盐。
发酵过程镉盐添加浓度的确定酿酒酵母B-3GSH发酵第11h时，向发酵液中添加不同体积0.50mol/L的镉盐母液，使各发酵液中镉盐的最终浓度分别为0、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、5.0mmol/L、7.0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L，发酵22h后测定菌体生物量，结果见表1。由表1可知，当发酵液中镉盐浓度达到5.0mmol/L时，对菌体生长的影响比较明显。因此，下述实验选择发酵过程中添加低于5.0mmol/L浓度的镉盐，以消除发酵过程中镉盐对菌体生长的影响。
发酵第11h和第21.5h添加镉盐对酿酒酵母B-3GSH生成量影响酿酒酵母B-3GSH发酵第11h和第21.5h（即发酵结束前0.5h）时，向发酵液中添加不同体积的0.50mol/L镉盐母液，使各发酵培养基中镉离子浓度为0、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、1.7mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L，发酵22h后测定GSH生成量。由图2、图3可知，酿酒酵母B-3GSH发酵第11h和第21.5h（即发酵结束前0.5h）分别添加2.0mmol/L和1.0mmol/L镉盐，GSH产量比没有添加镉盐时分别提高了27.4%和47.3%，而胞内GSH含量则分别提高70.1%和45.0%。结果表明，酿酒酵母GSH发酵中期和末期，添加适量的镉盐可以有效提高GSH产量。有研究表明，重金属（如镉、砷）可以特异性阻遏酵母硫代谢途径中转录促进因子Met4遍在化失活作用，从而使Met4保持转录促进活性，增加GSH生成量以达到解除重金属毒害的作用[10]。上述实验也验证了添加一定浓度的镉盐可以提高酿酒酵母GSH生成量。但是，由于镉盐具有很强的毒性，不能在GSH发酵过程中以直接添加诱导GSH生成的形式达到高产的目的，这样既影响GSH的下游分离与工业废水处理，又不符合食品安全规定。因此，能否采用诱变育种方法获得高镉盐抗性的酿酒酵母突变株，通过增加酵母自身的镉盐抗性，将这种镉盐诱导型提高GSH的生成方式转变为组成型，在不添加镉盐条件下提高GSH生成量，将是下面研究的主要方向。
酿酒酵母GSH生成量与其镉盐抗性之间关系的验证本实验室现存有一株利用复合诱变方法，经ZnCl2抗性平板筛选得到的一株高产GSH酿酒酵母突变株B-3和多株经离子注入所得的BL系列高产GSH突变株，其GSH生成量均明显高于酿酒酵母BY-14。本部分研究，以上述菌种为实验菌株，通过菌株GSH生成量和镉盐抗性比较，验证酿酒酵母GSH生成量与其镉盐抗性之间的关系，为高镉盐抗性酿酒酵母突变株筛选体系的建立奠定了理论基础。2.2.1酿酒酵母GSH生成量比较按照方法1.2.2，对BY-14、B-3、BL17、BL19、BL31分别进行GSH发酵实验，测定其GSH生成量，结果见表2。由表2可知，酿酒酵母B-3、BL17、BL19和BL31GSH产量和胞内GSH含量均明显高于酿酒酵母BY-14。2.2.2酿酒酵母镉盐抗性比较按照方法1.3.1，将酿酒酵母BY-14划线接种于浓度分别为0、0.30mmol/L、0.35mmol/L、0.40mmol/L、0.45mmol/L、0.50mmol/L、0.55mmol/L、0.60mmol/L的镉盐抗性平板上，30℃培养3d~4d，观察其菌落生长情况。由表3可知，酿酒酵母BY-14在0.50mmol/L镉盐抗性平板上有较弱的生长，而在0.55mmol/L镉盐抗性平板上不能生长。故选择含0.55mmol/L镉盐的YEPD平板作为镉盐抗性验证平板。将酿酒酵母BY-14、B-3、BL17、BL19、BL31分别划线接种于含0.55mmol/L镉离子的YEPD平板上进行镉盐抗性验证，30℃培养3d~4d，观察菌体生长情况，结果见图4。由图4可知，除菌株BY-14外，其余4株菌在含有0.55mmol/L镉盐的抗性平板上均生长良好。实验表明，酿酒酵母B-3、BL17、BL19、BL31镉盐抗性高于BY-14。以上结果表明，酿酒酵母BY-14GSH生成量明显低于B-3、BL17、BL19、BL31；同时，BY-14镉盐抗性也明显低于其他实验菌株。因此，可以初步确定酿酒酵母GSH生成量与其镉盐抗性之间的关系，即酿酒酵母GSH生成量越高，其镉盐抗性越强。反之，镉盐抗性越强，其GSH生成量越高是否成立，仍须实验予以证明。因此，后续实验将利用紫外诱变方法，通过镉盐抗性筛选获得高镉盐抗性酿酒酵母突变株，如果可以获得GSH生成量提高的正突变株，就为建立一种高产GSH酿酒酵母突变株的筛选方法提供了实验依据，同时，也会为酿酒酵母GSH生成量与其镉盐抗性之间关系作出重要补充。
镉盐抗性筛选平板的确定按照方法1.3.1，将酿酒酵母B-3和M8划线接种于含有不同浓度镉盐的抗性验证平板上，30℃培养3d~4d，观察其菌落生长情况，结果见表4。由表4可知，酿酒酵母B-3、M8在0.20mmol/L和0.30mmol/L镉盐抗性平板上有较弱生长，而在0.25mmol/L和0.35mmol/L镉盐抗性平板上不能生长。故选择含0.25mmol/L、0.35mmol/L硫酸镉的YEPD平板分别作为酿酒酵母B-3和M8紫外诱变初筛平板。#p#分页标题#e#
高镉盐酿酒酵母菌株的筛选以40s作为紫外线照射剂量，按照方法1.3.2对酿酒酵母B-3和M8进行紫外诱变，取照射后的菌液1mL，经生理盐水梯度稀释后，取0.1mL稀释液分别涂布于0.25mmol/L和0.35mmol/L的镉盐抗性平板上，30℃避光培养3d~4d后获得68株镉盐抗性提高的酿酒酵母突变株。按照出发菌株不同分为BV系列和MV系列突变株2类。其中，BV系列突变株39株，MV系列突变株29株。
高镉盐抗性酿酒酵母突变株GSH生成量复筛按照方法1.2.2，利用高镉盐抗性酿酒酵母突变株与各自的原株分别进行GSH发酵实验，测定其GSH生成量。部分GSH产量和胞内GSH含量较原株明显增加的突变株分别列于表5、表6。由表5可知，突变株BV27、BV54和BV55GSH产量比原株B-3均有提高。其中，突变株BV54GSH产量为151.88mg/L，较原株B-3GSH产量增加15.89%；同时，各突变株胞内GSH含量比原株B-3均有较大程度的提高，其中，突变株BV54提高32.53%，胞内GSH含量达到33.53mg/g。由表6可知，所列突变株GSH产量均比原株M8有所提高，其中MV16GSH产量提高最显著，达到79.27mg/L，较原株M8增加33.29%；同时，突变株MV16胞内GSH含量比原株增加36.55%。实验表明，这种利用紫外诱变经镉盐抗性初筛和GSH生成量复筛获得高产GSH酿酒酵母突变株的育种方法是可行的。此外，通过高镉盐抗性酿酒酵母突变株GSH生成量复筛表明，68株高镉盐抗性酿酒酵母突变株中，GSH产量或胞内GSH含量比原株明显提高的正突变株有16株（部分数据未列出），正突变率为23.5%。其中，GSH产量和胞内GSH含量均有较大幅度增加的突变株有2株。结果表明，酿酒酵母镉盐抗性越强，其GSH生成量不一定越高。同时，这一结果也对实验2.2结论做了补充。
（1）在酿酒酵母B-3GSH发酵第11h添加5.0mmol/L以下浓度的镉盐，可以有效的减少镉盐对于发酵菌体生物量的影响；同时验证了酿酒酵母B-3GSH发酵过程中添加适量浓度的镉盐可以有效提高其GSH生成量。（2）通过酿酒酵母GSH生成量与其镉盐抗性关系验证实验发现，酿酒酵母GSH生成量越高，其镉盐抗性越强。（3）利用紫外诱变方法分别对酿酒酵母B-3和M8进行处理，经镉盐抗性初筛和GSH生成量复筛后，获得2株GSH生成量明显提高的突变株BV54和MV16。结果表明，利用镉盐抗性筛选高产GSH酿酒酵母突变株的筛选方法是可行的，为高产GSH酿酒酵母菌株的筛选提供了新思路；同时，也对酿酒酵母GSH生成量与其镉盐抗性之间的关系进行了补充，即酿酒酵母镉盐抗性越强，其GSH生成量不一定越高。