同义替换速率（dS）或非同义替换的速率（dN）是一年中或一个世代内一个同义位点上发生同义替换的数目或一个非同义位点上发生非同义替换的数目。实际上，由于不知道2个序列的分歧时间，因此，习惯上总是考虑一对序列的平均每个同义位点上发生同义替换的数目或平均每个非同义位点上发生非同义替换的数目。dS等于dN时（即ω＝1），表明没受到自然选择；dS大于dN时（ω＜1）表明受到负选择；dS小于dN时（ω＞1）表明受到正选择［1］。光敏色素（Phy）是一类红光／远红光受体，在植物整个生长发育过程中都起重要的调节作用［2－4］。Phy分子是由大约1100个氨基酸残基的脱辅基蛋白和1个线性的四吡咯环生色团通过共价键链接构成。其N端是光感受区，包括后色胆素裂解酶亚结构域（Bilinlyasedomain，BLD）和光敏色素亚结构域（Phytochromedomain，PHY），GAF（cGMP－specificphosphodiesterase／adenylatecyclases／formatehydrogenlyasetranscription）结构域包含于BLD结构域中，是发色团结合的部位，高度保守［5－6］；C端是光调节区，光调节区域含有2个PAS（Per／Arnt／Sim）同源重复序列和1个组氨酸激酶类作用区（Histidinekinaserelateddomain，HKRD）。研究表明，GAF结构域某些位点发生突变，可能会严重影响脱辅基蛋白和发色团的结合［7］，从而影响光敏色素的生理功能。试验的前期研究发现，在裸子植物PHY进化过程中，GAF结构域中存在2个正选择位点［8］，但是并未涉及C端的其它结构域。PHYB存在于被子植物，和裸子植物中的PHYP同为B类光敏色素基因。Yang等［9］和Mathews等［10］在对被子植物光敏色素A－C／F基因以及光敏色素B－D／E基因的分析中检测到了正选择。但是Yang等选用的基因序列有限，每个光敏色素类型只有1条基因序列。样本的大小可能会影响检测结果。因此，现在前期研究工作的基础上，采用16条光敏色素基因序列，检测了分别存在于裸子植物和被子植物中同为B类光敏色素的PHYP和PHYB基因的光感受区，以期了解这2个基因的光感受区是否经历选择压力以及经历同样的选择压力，从而深化对该区域功能的认识。 1材料与方法 1．1试验材料 试验采用了8条裸子植物的PHYP光感受区序列，8条被子植物的PHYB光感受区序列进行适应性进化分析。其中被子植物的序列数据以及外类群风兜地钱（MarchantiapaleaceaBertol．var．diptera（Mont．）Hatt．）的序列数据取自GenBank（序列名称及登陆号见表1）；裸子植物序列由测序所得，植物材料均采自中国科学院武汉植物园。 1．2总DNA提取、PCR、克隆和测序 用于DNA提取的材料为新鲜的叶片，方法采用改进的CTAB法［11］。扩增PHYP光感受区序列采用的引物是根据王静得到的南方红豆杉PHYP序列（数据未发表）和欧洲赤松PHYP的cDNA序列（X96738）设计，引物为2对（表2），第1对扩增BLD结构域的序列，第2对扩增了PHY－PAS1结构域的序列。测序完成后，光感受区域序列由这2个部分通过Editseq软件拼接而成。每25μLPCR反应体系中包括：模板50ng，引物各8pmol，TaqDNA聚合酶2U（Takara，大连）和由Takara提供的10倍PCR缓冲液2．5μL及2．5mmol／LdNTPs0．5μL。聚合酶链式反应（PCR）在BiometraPCR扩增仪上进行（Thermobio，德国）。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃60s，72℃90s，35个循环；72℃10min。PCR产物在1．0％琼脂糖凝胶、1×TAE电泳液中电泳35min（电压为120V），切下目的片段，用QIAEXII（Qiagen，德国）柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。回收所得产物与PMD19－T载体在4℃下连接16h，然后转化导入由大肠杆菌DH－5α所制的感受态细胞。感受态细胞在含有X－Gal、IPTG和氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上培养12h，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆。至少有3个阳性克隆送至英俊公司，用ABI377型自动测序仪测序，测序引物为M13＋／M13－。为了保证测序的准确性，对所得序列的正、反链进行测定并加以校准。 1．3数据分析 根据文献［12］，对PHYP和PHYB的分析是以地钱类风兜地钱为外类群。序列经ClustalX1．81［13］软件比对，个别位点进行适当人工校正。采用最大简约法（MaximumParsimony，MP）构建分子系统树。空位（Gap）被编码为缺失（Missing）。MP分析使用PAUP［14］软件进行，采用如下选项：树二组重新连接（TreeBisection－reconnection，TBR）、启发式搜索（Heuristicsearch）、多重性选择（MULTREESoption）、ACCTRAN优化和100次随机附加的重复。利用自展分析（Bootstrap，1000次重复）检验各分支的置信度。在该研究中，采用PAML4［15］分析方法中的3个模型：分支模型［16］、位点模型［17－18］以及分支－位点模型［19－20］进行分析。采用系统发育分析得到的MP树文件，以及该分析中的密码子矩阵。目的分支在图1中以字母标出，ω0是背景比率。整个分析采用PAML4软件包中的Codeml程序完成。 2结果与分析 2．1构建的系统发育树 图1是基于裸子植物PHYP和被子植物PHYB光感受区序列构建的MP树，这2个类型的光敏色素分别聚在不同的2个分支。在PHYP分支中，红豆杉＋白豆杉与香榧＋穗花杉形成姊妹群（bootstrap＝83），然后和三尖杉聚在一起（bootstrap＝95），池杉和柳杉＋日本柳杉形成一个分支且得到有力支持（bootstrap＝100），该分支同红豆杉科和三尖杉科聚在一起（bootstrap＝100），共同构成欧洲赤松的姊妹群（bootstrap＝100）。在PHYB分支中，单子叶植物水稻（OryzasativaJaponica）＋高粱（Sorghumbicolor）形成一个分支，双子叶植物马铃薯（Solanumtuberosum）、烟草（Nicotianatabacum）、番茄（Lycopersiconesculentum，tomato）、杨（Populustremula）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）形成另外一个分支，支持率很高（bootstrap＝100）。#p#分页标题#e# 2．2选择压力的分析 由表3可知，裸子植物PHYP和被子植物PHYB光感受区不同模型下的似然值以及参数估计。单比率模型包括35个参数，在该模型下，似然值l0＝－10535．68，ω0＝0．051。三比率模型假定3个不同的ω，即ωP、ωB以及ω0，分别表示P、B分支以及背景分支上的ω值（图1），这2个模型相互比较时，自由度是2，2Δl＝2（－10529．55－（－10535．68））＝12．26，χ2测验显示P＜0．01。该结果表明，这2个分支的确有不同的ω。自由比率模型假定每个分支都有自己的ω。在该模型中，大部分分支的ω小于1，所以它们处于加强的负选择下（图1）。但是分支a、b、c、d可能处于减轻的负选择甚至正选择下，因为它们的ω大于1（表3）。不过，分支a的ω无穷大是源于缺乏同义替换。在该分析中，自由模型下的似然值l1＝－10471．25（表3），该模型共有67个参数，和单比率模型比较，2倍的似然值差异为2Δl＝128．86。依χ2分布，自由度df＝32检验显著性，结果表明，该模型显著优于单比率模型。位点模型假定位点间的选择压力在变化而分支间的压力不变化，而分支－位点模型认为选择压力在位点间和分支间都改变。运用这2个模型可以检测那些受到正选择的位点。位点模型从分支P和B上都没有检测到受到正选择的位点，但是分支－位点模型从分支B上检测到了正选择位点（P＞95％：320R、22G、93C、244S、261G、265W），而在分支P上没有检测到（表3）。 3结论与讨论 裸子植物的PHYP和被子植物中的PHYB同为B类光敏色素［21］，试验对这2个类型PHY基因的光感受区研究发现，被子植物PHYB的分支中在P＞95％的水平上有6个正选择位点的出现（表3），该研究结果和Yang［9］在对被子植物光敏色素B－D／E的研究中检测到了正选择位点的结果保持一致。这说明，样本的大小对研究结果影响不大。在该区域构建的系统发育树中，强烈的正选择压力趋向于发生在裸子植物近期分化的属内种间的谱系中，而在相对距离较远的古老谱系中缺少这种压力（图1），并且，尽管在少数较近的PHYP分支（Recentlineages）中检测到有正选择的发生，但是没有检测到正选择位点，该结果与试验前期研究裸子植物PHYP的PHY－PAS1结构域适应性进化的结果类似［22］。裸子植物PHYP和被子植物PHYB基因的这种差异可能是由光敏色素的进化速率不同引起的。据Schneider－Poetsch等［21］报道，裸子植物光敏色素的进化速率要低于被子植物光敏色素。因此，裸子植物和低等植物的光敏色素进化距离要小于被子植物的光敏色素。所以，即使裸子植物PHYP的光感受区发生过正选择（图1，分支a，b，c，d），但是可能目前的模型还不够灵敏，不能准确鉴定出该区域中的正选择位点。