反硝化作用是生态系统氮循环过程中一个重要的组成部分，能够导致农田土壤氮素损失，降低土壤肥力，促进温室气体N2O排放。但是从生态学的角度考虑，反硝化作用能够把生态系统固定的氮和人为活化氮以N2的形态返回到大气氮库中，是活性氮最终以惰性氮离开土壤、水体等内部生物循环而回到大气的唯一自然途径[1]。因此，反硝化过程能够去除水体中的硝态氮，调节水体质量，平衡生物固氮输入通量，减少活性氮对环境和气候变化的影响。虽然有关反硝化的研究已经取得了很大进展，但是迄今为止仍然没有一种合适的方法来量化反硝化速率[2]，主要原因有：（1）大气和水体中氮气的环境背景值很高，从而使得测定反硝化产生的微量氮气存在很大困难；（2）反硝化过程具有很大的时空变异性；（3）目前所采用的方法大都是改变了底物浓度，或者破坏了样品的物理环境，从而不能获得真实的反硝化速率；（4）不同研究者在反硝化测定方法上缺乏交流，从而阻碍了反硝化的研究进展。因此，本文综述了目前在陆地和水体生态系统中几种常用的测定反硝化速率的方法，并针对这些方法的优缺点进行讨论，以期为今后反硝化测定方法的进一步研究提供参考。 1目前常用的反硝化测定方法 1.1乙炔抑制法 采用乙炔抑制法来研究反硝化是基于高浓度乙炔能够抑制硝化作用以及N2O向N2的还原[3]，从而使得N2O成为反硝化的终产物。由于N2O在大气中的浓度很低，因此很容易测得N2O的产生量，从而间接推算出反硝化速率。乙炔抑制法主要包括箱法和土柱方法。最早使用的乙炔抑制法是向原位箱下的土壤中灌注乙炔[4,5]，但是这种方法费力，难于操作。基于这个缺点，研究者们开始采用土柱方法。土柱法包括动态土柱法和静态土柱法，所谓动态土柱法是指使用通气泵促使乙炔和土壤空气在土壤大孔隙中循环，然后在2小时之内连续测定N2O的浓度变化以计算反硝化速率[6]。但是由于气体是采用强制泵入的方式，容易导致土柱中压力的变化，进而破坏土壤结构、影响气体扩散。静态土柱法则是把乙炔注入到一个密封的容器中，经过一定时间均衡后测定N2O的积累速率[7]。与动态土柱法相比，静态土柱法不存在气体循环过程，并可进行大量样品测定，但是乙炔扩散进入土柱以及N2O扩散出土柱都有一定的限度[8]。用乙炔抑制法测定反硝化速率操作简单便捷，成本低，可以进行大批量样品的同时测定。其主要不足之处是乙炔抑制了硝化作用，当NO3-成为反硝化的限制因子时，将低估反硝化损失量[9]，从而影响测定结果的准确度。此外还存在一些其它问题：（1）在粘土或者饱和沉积物中，乙炔扩散速率很慢，对硝化作用抑制不完全[10]；（2）长期反复使用乙炔会导致反硝化微生物对乙炔的适应，将乙炔作为一种碳源，消耗乙炔，从而导致浓度降低，抑制效果下降[11]；（3）在土壤碳含量较高而NO3-浓度较低时（<10μmolL-1）可能促进N2O的还原而削弱乙炔的抑制效果[11,12]；（4）乙炔中的杂质气体（如丙酮）会影响反硝化过程[13]。最近还有研究表明，在有氧气存在的情况下，高浓度乙炔（大于0.1kPa）会促进反硝化产生的NO分解或者催化NO的氧化，从而低估反硝化速率[14]。虽然乙炔抑制法存在很多问题，但由于迄今为止还没有一个令人十分满意的测定反硝化的方法，所以这种方法仍被广泛使用[2]。如目前对于反硝化潜势和反硝化酶活性的测定，普遍采用的都是乙炔抑制法[13]。低浓度乙炔能够抑制硝化作用，高浓度乙炔不仅能抑制硝化作用，还能抑制反硝化作用过程中N2O向N2的还原。因此，Kester等[15]通过向土壤中添加不同浓度的乙炔，量化了林地、草地、河水底泥中硝化作用和反硝化作用对N2O排放的贡献。Ullah[16]采用乙炔抑制法研究了农业流域内不同利用类型土壤的反硝化能力及其影响因素，并估算了反硝化作用对流域内硝态氮的去除能力。虽然这种方法可能低估了反硝化能力，但仍使人们认识到了反硝化作用对于去除活性氮的重要作用。 1.215N同位素示踪法 同位素示踪法包括15N平衡差值法和15N示踪气体直接测量法。15N平衡差值法是基于微区试验中不存在径流损失，氮的当季淋洗损失又极低，而把所有的氮素损失都作为气态损失的基础上建立的。廖先苓等[17]把从15N微区试验中测得的氮素总损失量扣除氨挥发损失量后作为硝化-反硝化损失量，其优点是15N的丰度和氨挥发量可准确测定，其主要缺点是测定结果是硝化和反硝化的共同气态损失，不能区分两个过程对氮转化的具体贡献[18]。此外，李振高等认为[19]微区施入的15N与土壤原有15N进行交换，土壤中气体逸出受阻使测定值偏低，再加上氮总损失量、氨挥发量等各个环节的测定，使得最终的测定误差很大。15N示踪气体直接测量法是向土壤中添加15N标记的NO3-，然后测定产生的N2和N2O的15N来量化土壤的反硝化速率[20]。这种方法出现于50年代末，80年代广泛应用于旱地，近年来才被用于测定稻田土壤和沉积物的反硝化损失。Petersen[21]向原状沉积物柱样中分别加入15NO3-和15NO2-，通过测定15N2的量，不仅计算出反硝化速率，而且还量化了厌氧铵氧化对N2排放量的贡献，并指出沉积物中铵态氮硝化产生的NO3-是反硝化的主要氮源。虽然15N示踪气体直接测量法也存在气体扩散受阻、标记不均匀等缺点，但因其具有较高的灵敏度使得此种方法仍然得到了广泛应用并推动了反硝化过程的研究。使用15N同位素示踪技术是建立在假定施入到土壤中的15N能够和土壤本底15N快速均匀混合的基础上。理论上讲，由于土壤结构不均一、存在扩散障碍物、生物扰动、同位素分馏等因素使得在静态土柱中很难达到这种快速均匀混合的状态。但Steingruber等认为[22]，同位素的非均匀混合对反硝化测定结果的影响很小，所导致的误差不超过10%。其他研究表明[23]，即使土壤中的NO3--N标记是不均匀的，仍能对反硝化产生的N2作出准确的估计，因为非均匀混合所导致的误差可能远远小于实验系统误差。值得注意的是，有报道指出土壤微生物倾向于利用轻质同位素，从而使得该方法低估了反硝化的发生程度[19]。此外，向氮源缺乏的生态系统中添加15N标记的NH4+、NO3-可能会增加可利用的氮源，从而高估反硝化速率，因此这种方法最好用在氮素含量较高的生态系统中[23]。 1.3N2直接量化法#p#分页标题#e# 大气中的N2含量高达79%，在这样高的背景值下，很难直接测定土壤反硝化产生的微量N2。1956年，Nommik最先提出用密闭系统培养原状土、沉积物和土壤植物生长系统来直接测定反硝化产生的氮气[24]。基于这种密闭体系，广泛用来测定反硝化的方法是气体流动培养技术[25,26]，即在密闭系统中，使用连续流动的He或者Ar来清除N2背景含量，在不添加抑制剂的情况下，培养原位土柱来测定反硝化产生的N2和N2O。因为室内培养比较容易控制环境条件，所以N2直接量化法被广泛用于反硝化作用的影响因素研究。早在1978年Wickramasinghe[25]就用这种方法研究了不同氮浓度（0,30,100,300kgNha-1）对土壤反硝化的影响，结果表明氮施用量为100kgNha-1时气态氮损失最大，大约有59%的硝态氮以N2和N2O的形式损失掉。Scholefield[26]采集了英格兰西南部草地土壤原状土柱，用气体流动培养技术研究了氮浓度、水分、pH、温度对反硝化排放的N2O和N2O/N2比的影响，使人们对反硝化气态产物的排放比例有了更深的认识。气体流动培养技术有很多优点：（1）采用非扰动土，可以真实的反映土壤反硝化速率；（2）不需要加入氮素示踪剂，对土壤氮素底物没有干扰；（3）不需要添加抑制剂，这对于自然环境下的反硝化研究非常重要。而且，一旦建成了密闭系统，这种方法应用很简单，可以用来测定土壤、沉积物、水中的反硝化速率以及进行参数模拟试验。但是Nommik指出[24]，建立密闭系统，无论在设计上，还是建造过程方面都非常复杂。此外，完全清除系统中的氮气需要一定的时间，很难保证系统的密闭性，在保证气体取样的精确性和无污染方面也存在一定困难。目前，气体流动培养技术主要用于测定反硝化产生的N2和N2O。将来我们可进一步改进这种方法用于测定反硝化过程中排放的NO，这样就可以同时测定反硝化产生的三种气态产物，从而使我们更好地理解反硝化的发生过程。 1.4质量平衡法 质量平衡法是根据系统中氮素输入和输出量的差值来估测反硝化损失，这种方法一般应用在大尺度的陆地生态系统或水体生态系统中[27]。质量平衡法可表示为：氮素输入-氮素输出=氮素储存+反硝化损失。陆地生态系统中氮的输入项包括肥料投入、生物固定、干湿沉降，输出项包括作物吸收、地表径流、秸秆焚烧、NH3挥发等。对于陆地生态系统而言，氮存储量的变化一般很小，可以忽略不记，因此输入和输出量之差即为反硝化损失量。然而David[28]用质量平衡法估算美国伊利诺伊州的氮素收支平衡时发现，农业流域中氮的存储量很大，因此对反硝化的估测容易产生误差。质量平衡法也可以用来估测河流或海洋的反硝化速率，如Pribyl[29]监测了美国中部普拉特河流各种氮素输入量（干湿沉降、地下水渗入、径流注入等）和输出量（蒸发、渗出、流出等）的大小，然后应用质量平衡法计算出河水中反硝化对氮的去除速率为2.11gNm-2d-1。Emery[30]用质量平衡法估算出全球海洋生态系统中每年大约有70×1012g氮通过反硝化消耗掉。应用质量平衡法测定生态系统反硝化发生程度的前提是：假定所研究的系统处于稳定的状态，并能准确量化各种氮输入和输出量的大小。但是Seitzinger认为[31]在大尺度的陆地生态系统中，短时间内氮素输入和输出量的变化都很小，很难用质量平衡法监测到微量的反硝化损失，即便测定出反硝化损失，也有很大不确定性。而在海洋生态系统中应用质量平衡法测定反硝化的主要问题是，无法确定海洋是否处于一个稳定的状态，对结果估测的准确性很低[30]。尽管存在上述缺点，对于大尺度陆地生态系统而言，质量平衡法仍旧是量化反硝化发生程度的一个比较好的方法，而且通过多年的观测结果可以获得相对准确的反硝化损失量。 1.5N2:Ar比测量法 与陆地生态系统相比，测定水体中反硝化产生的N2要容易得多。因为土壤和大气存在着自由气体交换，而在深水饱和密闭系统中基本不发生气体交换，而且水中的氮气背景值很低，这使得我们能够相对容易的测定水体中反硝化的真实速率。目前常用的方法是N2:Ar比方法，该方法使用连续流动的水体不断冲洗沉积物柱样以模拟水体中的动态过程，然后定期采集进水口和出水口的水样，用膜进口质谱仪测定水中的N2:Ar比，同时测量水流速度和土柱表面积来计算反硝化速率[32,33]。因为膜进口质谱仪对N2:Ar比的测定精度很高（N2:Ar比检测限为0.03%），而且Ar是惰性气体，含量非常稳定，因此这种方法可以相对准确的测定非扰动水体沉积物的反硝化速率，并具有很高的时间分辨率，测量速度快（<2min），样品进样量小（<7mL），操作简单[34]。这种方法的主要缺点是需要建立复杂的密闭系统，而且降低N2背景值需要的时间很长。基于N2:Ar比测量法的优点，今后可以把这种方法加以改进，以应用于N2背景值很高，气体交换量很大的陆地生态系统中反硝化作用的测定。1998年，Kana[32]最早使用N2:Ar比方法测定了河水沉积物的反硝化速率，随后采用这种方法量化了美国切萨皮克海湾的反硝化速率[35]，并指出N2:Ar比方法可以用于大尺度水体生态系统反硝化的测定。Pribyl通过比较发现[29]，用N2:Ar比方法测定大尺度河流反硝化的精度要比质量平衡法高。使用N2:Ar比测量法测定的反硝化速率是净反硝化速率，即总反硝化速率与总氮固定速率的差值。An等人研究表明[36]，同时使用N2:Ar比方法和15N同位素示踪法可以用来区分环境体系内的反硝化和固氮过程。Smith等研究发现[33]，上述两种方法的联用同样可以用来测定深层水体中硝化—反硝化偶联对N2排放量的贡献。最近Khalil和Richards[37]用N2:Ar比方法研究了黑麦草和三叶草地不同深度土壤的反硝化潜势和反硝化酶活性，并指出用N2:Ar比方法测定旱地土壤反硝化潜势的精度很高，但是需要去除O2对测定过程的干扰。 1.6化学计量法 化学计量法主要用于估算水体环境中的反硝化，这种方法源于1934年Redfield观察到海水中浮游植物和深层海水中的植物具有相同的元素组成比率（C∶N∶P=106∶16∶1），因此断定海水中有机物质的元素组成稳定[38]。基于这种发现，如果当一种具有已知元素比率组成的有机物在氧气或其它电子受体（NO3-，SO42-）的参与下分解生成一系列已知的产物（CO2，H2PO4-，NO3-等），通过对电子受体的消耗量或者磷酸盐、CO2和NO3-的生成量，就能够计算出NO3-的生成量或消耗量，NO3-的理论值和观测值之间的差异就是反硝化损失量。化学计量法实质上是建立在质量平衡法基础之上的，只不过由于有机物的元素组成固定，我们可以通过其它元素通量的准确变化来计算氮素的变化。目前，化学计量法被广泛用于测定海洋及港湾的反硝化。如Codispoti[39]用化学计量法估算出阿拉伯海域中每年大约有30×1012gN通过反硝化去除掉；Joye[40]使用化学计量法研究了美国托马斯海湾沉积物的反硝化速率，并指出即使沉积物中存在硝化-反硝化偶联，运用化学计量法仍能对反硝化速率做出准确的估算。然而，化学计量法在淡水中的应用较少，这是因为淡水中有机物质的元素组成没有海水稳定[41]，由此获得的测定结果比在海水中的误差要大。然而Codispoti等指出[39]，在海水中，由于有机物质可能会与沉积物或者大气发生反应，导致其分解过程中的化学定量关系存在很大的不确定性，因此用化学计量法估算全球海洋中反硝化的发生程度存在一定的误差。尽管如此，在进行大尺度、大区域体系内反硝化的研究时，化学计量法仍不失为一种较好的估测水体（如海洋）反硝化的方法。#p#分页标题#e# 1.7环境示踪剂法 N2:Ar比测量法和化学计量法对于短期内水体反硝化速率的测定具有一定的优势，但不适用于几十年甚至几百年内水体反硝化的研究，而环境示踪剂法在一定程度上可以弥补这种不足。NO3-在水体迁移转化过程中其浓度的降低可能遵循0级或1级反应速率，过程公式可以表示为：(Ct2-Ct1)=-k0×(t2-t1)或者(Ct2/Ct1)=exp[-k1×(t2-t1)]，其中Ct指t时间的NO3-浓度（t2>t1），k0是0级反应速率常数，k1是一级反应速率常数。使用此公式计算原位水体中的反硝化速率必须知道时间变化。环境示踪剂法通过监测水中自然组分如氚（3H）、氦（3He）、碳（14C）的同位素数值，根据其质量衰变来计算时间变化，从而提供估测反硝化速率所需的时间信息。Cook和Herczeg[42]根据14C的质量衰变估算了时间的信息，研究发现深度为60m的地下水在7000年内的反硝化速率为7×10-5μmolNL-1d-1。他们同时指出，由于研究区域空间范围大，所以变异较小，但是操作方法复杂，而且研究系统区域很难确定，对最终的结果很难解释清楚。此外，环境示踪剂数据不够精确，致使对反硝化速率的估测不准确，但对于长时间尺度范围内水体反硝化的定性研究仍具有重要意义。 2反硝化测定方法研究展望 生态系统中的反硝化过程一直是研究者所关注的热点问题，针对反硝化测定的相关研究也取得了很大进展，但是仍旧没有一种非常好的方法来量化反硝化速率，尤其是陆地生态系统中N2的背景值很高，导致很难定量反硝化产生的微量N2。尽管如此，近年来发展起来的一些方法如气体流动培养技术和15N同位素示踪技术在很大程度上促进了陆地生态系统反硝化的研究。然而反硝化研究的推进不仅取决于测定方法的改进，还与分析仪器的精密度密切相关，如能研制出测定精度更高的质谱仪和气相色谱仪，势必能推动气体流动培养技术和15N同位素示踪技术对反硝化的研究。广泛应用于水体反硝化研究的N2:Ar比测量法其测定精度较高，具有很多优点，今后可以考虑把这种方法加以改进，用于研究陆地生态系统的反硝化过程。此外，虽然使用质量平衡法和化学计量法估算大尺度范围内反硝化的发生程度存在很大不确定性，但是对于大尺度生态系统反硝化的定性研究仍是今后可以沿用的方法。