材料与方法
1.材料与试剂:
新西兰无水奶油(上海爱普香精香料有限公司)；Palatase20,000L（丹麦诺维信公司）；0.2mol/L磷酸盐缓冲液(食品级)；0.1mol/L氢氧化钾标准溶液（分析纯）；95%乙醇（分析纯）；石油醚（分析纯）；酚酞；氢氧化钠-乙醇溶液（分析纯）；0.5mol/L盐酸标准溶液（分析纯）；中性乙醇（自制）；去离子水（自制）。
2.仪器与设备:ZNHW-Ⅱ型智能恒温电热套，巩义市予华仪器有限责任公司；PL203型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JB90-SH型数显恒速强力电动搅拌机，上海标本模型厂；DHG-9073B5-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；智能数显恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司。
3.试验方法
原料奶油基本成分分析方法:脂肪含量的测定：酸水解法GB5009.6-2003；蛋白含量的测定：微量凯氏定氮法GB5511-2008；水分的测定：干燥法GB5497-1985；灰分的测定：马福炉灼烧法GB5009.4-2010；过氧化值的测定：碘量法GB5538-2005；酸价的测定：滴定法GB5530-2005。
酶解产物的制备及处理:取150g无水奶油于0.2mol/L磷酸缓冲液中，将此混合物置于三角瓶中，加入0.25%的酶在50℃、以170r/min搅拌下进行酶解反应，分别在2小时、4小时、6小时、8小时、10小时取适量的反应物测定其酸价和皂化价，以脂解率为评价指标，在各个不同反应阶段，研究不同的酶添加量、底物浓度、酶解时间及pH对酶解产物的影响。
脂解率的测定:测定酶解反应混合物前后的酸值（AV）和皂化值（SV），根据公式（1-1）来计算脂解率：脂解率%=反应前后酸价变化含量/反应后的皂化值×100（1-1）式中：皂化值的测定[17]：约称量2g酶解产物加入到25ml氢氧化钠-乙醇溶液于锥形瓶中，接上回流冷凝管，在恒温85℃的水浴锅中煮沸约30分钟，待煮液透明后，取下回流冷凝管加入中性乙醇溶液10ml。向锥形瓶中滴加酚酞数滴，趁热用盐酸滴定红色消失。
4.奶油酶解工艺条件优化
单因素实验结果表明，当加酶量为底物干重的0.25%时与0.3%时基本保持水平，这时的脂解率不再随加酶量的增加而增加，同时考虑到生产工业化的成本，因此选择底物干重的0.25%作为酶添加量。同时随着酶解时间的增长，脂解率也会不断的增大，但酶解的目的不在追求脂解率的最大化，而在于能得到风味最佳的酶解基料，同时在单因素反应系列中不难发现，酶解反应到最后几个小时，脂解率基本保持一致，不再随反应时间增长而增大。此外，若酶解时间过长会导致长链脂肪酸释放过多，以至于基料带有明显的皂味；若酶解时间过短必会影响到中短链脂肪酸的释放，导致基料风味有缺陷，增香强度不够[18]，所以初步选定酶解时间为6小时，以底物浓度、酶解温度和pH值3个因素作为自变量，并以单因素试验结果为依据，以脂解率为响应值，利用Design-Expert7.0设计三因素三水平试验方案，建立二次回归方程拟合因素和响应值之间的函数关系，采用响应面分析法来确定最佳的酶解条件。
结果与讨论
1.原料奶油基本成分:酶法制备奶味香精基料可以选择多种原料，不同奶油原料有着不同的风味特点，为制得气味自然，滋味浓厚感突出的增香产物，除了乳脂肪外还需要适量能溶于水的小分子乳蛋白呈味物质。原料奶油基本成分见表1。
2.单因素试验结果
酶添加量对脂解率影响:在反应体系总量150g不变的条件下，固定奶油底物和缓冲液的相对质量比为85%，反应温度为50℃，pH为8，分别考察不同酶添加量（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）对脂解率的影响，并且分别在2小时、4小时、6小时、8小时和10小时取样分析不同酶解时间对整个反应的影响。结果如图1所示。图1结果表明，随着加酶量的增加，脂肪酶Palatase20,000L对无水奶油的酶解作用逐渐增强，当加酶量超过0.25%底物干重时，脂解率增加趋势变缓，说明酶已经达到饱和浓度，而且反应在6-10小时这个间段与0.3%底物干重时反应体系几乎重叠，说明当反应时间大于6小时，脂解率变化不明显，继续增加酶浓度及反应时间对酶解率的影响不大，所以选择最适酶添加量为0.25%底物干重。
底物浓度对脂解率的影响:脂肪酶在油水界面上具有较大的活性，因此催化作用需要有一定的水分来维持酶分子的活性构象，同时改变其分子构象暴露活性中心，使酶处于激活状态而表现一定的催化能力。当水分含量过低或过高时，酶分子的催化部位就不能和水分子紧密接触，进而不能很好的维持酶的活性分子构象，导致酶解能力降低[19]，因此，油脂水解需要一个适宜的底物浓度，为此本实验在保持反应总量不变的条件下，改变无水奶油与磷酸盐缓冲液的相对质量比来观察底物浓度对脂解率的影响，分别选择75%、80%、85%、90%、95%五个底物浓度，并且在不同时间段分析酶解时间对脂解率的影响，结果如图2所示。由图2可见，底物浓度对脂解率影响是明显的，在浓度处于75%到85%之间时脂解率迅速增大，而当底物浓度超过85%后脂解变化开始变缓，从90%上升到95%时脂解率反而呈减少趋势，由于脂肪酶活性仅需少量水就可以保持酶的活性，因此只要能够满足酶的活性，脂解率就会随底物浓度增大而增大，若底物浓度过大，则会产生底物对酶解反应有抑制作用，因此水解乳脂肪的最适底物浓度为85%。
pH对脂解率的影响:不同的pH值会影响到酶分子活性中心的催化基团的稳定性，进而影响整个反应体系的酶解速率，在固定酶添加量、底物浓度、温度及不同反应时间段，调节磷酸盐缓冲液的pH值来观察不同pH值对脂解率的影响，结果如图3所示。图3结果表明，在相同的实验条件下，当pH为8时，奶油酶解的速率是最高的，在各个不用的时间段也是在pH为8时最高，因此脂肪酶Palatase20,000L在pH为8时酶解活性最强，为此最适反应pH为8。
温度对脂解率的影响：不同的温度会影响到脂肪酶活性中心的分子构象分布及底物奶油的乳化状态，进而影响到整个反应的酶解速率，在温度低于最适温度时，酶活性较低，则反应速度较慢；当温度高于最适温度时会导致脂肪酶变性而减弱甚至失去催化活性，本试验选择5个温度条件，固定底物浓度、酶添加量及pH值在不同时间点分别取样来分析不同温度对脂解率的影响。结果如图4所示。从图中可以看出温度对脂肪酶Palatase20,000L影响是很明显的，当温度从40℃升高到50℃时脂解率是明显增大，而温度升高到50℃后脂解率就出现变缓趋势，处于50℃与55℃之间时达到最大值，但当继续升高温度时脂解率是明显下降，说明脂肪酶已逐步变性失活，同时随着反应时间的延长底物量不断减少，酶活力的下降，从反应6小时后，脂解率的增加已趋于平缓，在6、8、10小时这时间段反应速率曲线趋于重叠。因此脂肪酶Palatase20,000L的最适酶解温度在50℃左右。#p#分页标题#e#
3.响应面试验设计方案及结果:根据中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken[20-21]实验设计优化奶油酶解工艺，选用影响脂肪酶活性的3个主要因素：A（底物浓度），B（反应温度），C（pH值）。每一个自变量水平分别以-1、0、1进行编码，利用Design-Expert7.0软件进行3因素3水平的响应曲面试验设计，实验因素及水平设计见表2，响应面设计方案及结果见表3。
4.建立回归方程及统计分析:根据Design-Expert7.0软件对表3中的脂解率进行多元回归分析，得到脂解率对底物浓度、反应温度、pH的二次回归模型，该式表达了脂解率与各因素之间的变化规律，其二次多元回归模型为：脂解率（%）=28.8-2.23A+0.55B+2.26C-1.49AB+1.69AC-1.35BC-3.02A2-2.79B2-3.61C2对该模型进行方差分析，结果见表4。回归方程中各变量对指标影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度就越高。由表4可以看出，对脂解率变化所建立的回归模型是极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），最显著的因素一次项有A、B、C，二次项有AB、ACBC、A2、B2、C2。回归方程也是高度显著的，相关系数为R2=0.9869，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，其校正决定系数RAdj2=0.9430，表明有约0.06%的脂解率变化不能由该模型进行解释。利用该模型可以确定最佳奶油酶解工艺条件。
5.响应曲面分析
温度与底物浓度的交互作用:由图5分析可知，固定酶添加量0.25%底物干重、pH为8时，酶解时间在6h，当底物浓度较低时，随着温度的不断上升，脂解率也会显著增大；当温度在50℃～55℃范围内，奶油脂解率达到一个最大值，但当随着底物浓度的增大，脂解率逐渐减少。
pH与底物浓度的交互作用:固定酶添加量0.25%底物干重、温度在50℃反应6个小时，pH与底物浓度对脂解率的交互作用见图6。由图6可以看出，随着底物浓度的增大，脂解率先缓慢增大后是逐渐减少；当底物浓度较低时，随着pH值的增大，脂解率先增大后减少，在pH为8左右时，脂解率能够达到最大值。这与pH对脂解率的单因素试验中的分析结果是一致的。
pH与温度的交互作用:由图7分析可知，固定酶添加量为0.25%底物干重，底物浓度为85%，酶解时间为6小时，当酶解温度较低时，随着pH不断增大，脂解率呈迅速增大后缓慢减少，在pH值为8左右时达到最大值；当pH值较低时，随着反应温度不断增大，脂解率则呈先增大后减少的趋势，这两因素对脂解率的交互作用表现是明显的。
6.奶油酶解脂解率的最优值预测及验证
通过统计预测出奶油最佳酶解条件为：酶添加量为0.25%底物干重、底物浓度为83.3%、酶解温度为51℃、pH值为8.2。在此条件下酶解，由回归方程预测脂解率为29.47%。根据响应面分析法得到的最佳条件，进行了重复实验验证预测值，重复实验结果反应响应值与回归方程预测值吻合良好。结果见表5。
结论
本实验通过固定最佳脂肪酶Palatase20,000L，在对奶油酶解进行单因素实验后，固定酶添加量为0.25%底物干重，酶解时间6h之后，确定温度、底物浓度及pH为对脂解率影响最大的三个因素，因此选用这三个因素进行响应面的优化，分析表明较高和较低的pH与温度都不利于提高酶解反应的速率，而且较高的底物浓度也不利于提高酶解速率，最后得到酶解最佳条件：底物浓度为83%；酶解温度为51℃；pH值为8。然后根据这几个响应面法优化后的条件参数进行奶油酶解重复实验，得到脂解率为28.77%，在很大程度上优化了该酶解工艺，同时在此条件下也获得最佳的增香效果，为以后工业化生产提供了重要的理论依据。（本文图、表略）
本文作者：黎海彬 姚正晓 刘慧娟 江津津 陈林 张挺 单位：广州城市职业学院 广西工学院