作者：鲁金星 姜寒玉 李唯 单位：甘肃农业大学生命科学技术学院
从前人的研究结果来看，在低温条件下对不同葡萄品种抗寒性研究大都局限在生理生化指标的测定，而目前并没有一个统一的标准来对不同葡萄品种抗寒性进行测定及综合评价。同时前人在对其他生理胁迫，如抗旱性[6-7]、盐胁迫[8-9]、高温胁迫[10]及其他作物的抗寒性[11-12]等探讨较多，但对于葡萄抗寒性的测定及综合评价体系方面的研究报道很少，尤其是关于酿酒葡萄此方面的研究报道相对空白[2，13]。我们针对甘肃省河西戈壁地区特殊的气候条件，对该地区的6种砧木及酿酒葡萄品种进行相关生理生化指标筛选和综合评价，以期为该地区酿酒葡萄生产、种质筛选和新品种培育提供理论依据。
1材料和方法
1.1试验地概况及供试材料实验材料取自甘肃紫轩葡萄酒业酿酒葡萄种植园，该园地处祁连山北麓，位于北纬39°6′，该区属典型的大陆性荒漠气候，年均气温8.0℃，年极端最高气温为38.6℃，极端最低气温-31.7℃，最大冻土深度1.20m，年均气温日较差15.3℃，无霜期130d，年均降水量73.3mm；太阳总辐射达到560.12～576.84kJ•cm-2，pH7.5～8.8[14]；灌溉条件为滴灌，土壤为砂砾土。供试材料均为3a生葡萄植株，管理水平一致，栽培树形采用单株单蔓倾斜式上架，栽植密度为3m×0.5m，6个酿酒品种分别为‘双优’嫁接于‘贝达’（‘双优’+‘贝达’）、‘梅鹿辄’、‘贝达’、‘双红’嫁接于‘贝达’（‘双红’+‘贝达’）、‘赤霞珠’、‘维代尔’。于2011年4月15日（越冬后）每一品种选3～5株，每株剪取40～50cm长的1a生枝条1~2枝，立即用聚乙烯膜包裹剪口，放置冰袋中带回实验室置于-4℃冰箱备用。
1.2材料处理将供试材料随机选取数枝，剪成10~15cm的长度，先用流水冲洗，后蒸馏水冲洗数遍，滤纸擦干放入冰箱进行温度处理，设定温度依次为4℃（对照）、0℃、-7℃、-15℃、-20℃，处理时间为10h。将处理后的枝条在室温下恢复30min后避开芽眼切成3~5mm的薄片混匀后称取适量，测定各指标（3个重复）。
1.3测定指标及方法相对电导率参照李合生[15]方法使用DDS-12A型电导仪测定；POD活性采用愈创木酚法测定[16]；SOD活性采用氮蓝四唑（NBT）法测定[16]；CAT活性采用紫外吸收法测定[17]；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法测定[18]，可溶性糖含量测定采用蒽酮法[19]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定[16]。
1.4抗寒性综合评价应用隶属函数法[11，20-21]进行综合评判。（1）与抗寒性呈正相关的参数SOD、脯氨酸、可溶性糖、CAT计算公式:U（Xijk）=（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（2）与抗寒性呈负相关的参数电导率、MDA计算公式:U（Xijk）=1-（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（1）、（2）中U（Xijk）表示各指标的隶属度值；Xijk表示表示各指标值测定值；Xmax、Xmin为所有品种第k项指标的最大值和最小值。用各项指标隶属度的平均值作为树种抗寒能力综合评判标准，进行比较。
1.5数据分析实验数据采用microsoftofficeexcel2007和spss13.0软件进行统计及分析。
2结果与分析
2.1低温处理对不同酿酒葡萄品种相对电导率影响由表1可知，各酿酒葡萄品种在4～-20℃温度依次递减的条件下，低温对细胞膜的伤害逐渐增大，细胞膜透性逐渐增加。6个品种的相对电导率均呈现出显著递增趋势，4℃最低，-20℃最高，且各温度条件下电导率值差异显著（P<0.05），在-20℃时，各品种间的电导率差异较大，其中‘梅鹿辄’电导率最大（80.9%），‘贝达’电导率最小（62.24%）。一般选择相对电导率50%作为植物组织活性的耐性临界值，超过耐性临界值的温度可以作为半致死温度[22-24]。在高于-7℃各品种的相对电导率均小于50%，-7℃温度下‘梅鹿辄’（59.51%）、‘赤霞珠’（63.08%）、‘维代尔’（52.85%）电导率值均超过50%，‘双优’+‘贝达’、‘贝达’、‘双红’+‘贝达’的电导率在-15℃下分别为54.82%、55.68%、49.27%，说明‘梅鹿辄’、‘赤霞珠’、‘维代尔’的半致死温度高于-7℃，而‘双优’+‘贝达’、‘贝达’、‘双红’+‘贝达’的半致死温度在-15℃左右。同时推测-7℃左右是‘梅鹿辄’、‘赤霞珠’、‘维代尔’品种耐受的一个温度阈值，在此温度条件下，应注意加强这些品种防寒防冻的大田管理。
2.2低温处理对不同酿酒葡萄品种POD、SOD活性的影响由图1（A）可知，6个品种的POD活性随着温度的降低呈现逐步降低的趋势，‘梅鹿辄’和‘赤霞珠’在4～-20℃各温度条件下，POD活性显著低于其他品种（P<0.05）；在-7℃温度条件下，‘梅鹿辄’、‘贝达’、‘双红’+‘贝达’、‘维代尔’的POD活性较0℃降幅较大，分别为78%、53%、40%、53%，推测-7℃左右也是几种葡萄的耐受温度，可以在低于此温度下启动相关酶对细胞膜的保护措施。由图1（B）可知，所有葡萄品种SOD含量变化均呈现先升高后下降的趋势，但是各品种SOD活性到达峰值的温度及降幅不同，‘梅鹿辄’、‘赤霞珠’、‘维代尔’、‘双红’+‘贝达’均在-7℃左右时SOD活性达到峰值，在-7℃～-20℃时SOD活性差异显著（P<0.05），且较其他品种SOD活性降幅迅速，分别为30%、20%、26%、23%，说明低于-7℃葡萄品种的枝条已经受到一定程度的损伤，SOD对细胞膜的保护已经到达极限，酶系统受到破坏，SOD活性降低。‘贝达’和‘双优’+‘贝达’均在0℃左右时SOD活性达到峰值，低于0℃时SOD活性缓慢降低，推测在这2个品种中SOD的稳定性较低。
2.3低温处理对不同酿酒葡萄品种CAT活性的影响如图1（C）所示，随着温度的逐渐降低，6个葡萄品种的CAT含量均呈现先增后降的趋势，‘梅鹿辄’、‘贝达’、‘双红’+‘贝达’、‘赤霞珠’均在-7℃时CAT活性达到峰值，分别为90.88、103.58、99.5、96.13，在低于-7℃时CAT活性开始降低，其中‘梅鹿辄’降幅最小，推测-7℃为一个较为重要的温度拐点，可能同SOD一样，低于-7℃破坏了相关保护酶而CAT含量降低。‘双优’+‘贝达’CAT活性峰值出现在-15℃，低于此温度开始降低，而‘维代尔’在0℃时CAT活性已经达到了峰值，低于0℃时CAT活性开始降低。#p#分页标题#e#
2.4低温处理对不同酿酒葡萄品种MDA和脯氨酸含量的影响低温胁迫下，6种葡萄品种MDA含量变化如图2（A）所示，随着温度的降低，6种葡萄品种的MDA含量均呈现逐渐上升趋势，且其余低温处理均高于对照（4℃），在-20℃温度下MDA含量达到最大。其中‘双优’+‘贝达’、‘贝达’、‘双红’+‘贝达’的MDA含量较其他品种持续处于较低水平，且4℃～-20℃下MDA含量差异不显著（P>0.05），‘赤霞珠’和‘维代尔’的MDA含量居中，且差异不显著（P>0.05），而‘梅鹿辄’的MDA含量一直处于较高水平，且显著高于其他品种。从MDA含量的变化来看，在低温胁迫下‘梅鹿辄’的细胞膜系统的受损程度最高，膜脂过氧化程度最严重，膜透性最大。在低温胁迫下，6种酿酒葡萄品种脯氨酸含量变化如图2（B），反映了脯氨酸含量随着温度的降低呈现了持续升高的特征，说明在逆境条件下，葡萄对低温胁迫表现出积极的响应。总体来看，‘双优’+‘贝达’、‘贝达’和‘双红’+‘贝达’3个品种脯氨酸含量较高。
2.5低温处理对不同酿酒葡萄品种可溶性糖含量的影响如图2（C）所示，各品种都随着处理温度的降低而呈现出先增高后下降的趋势，‘梅鹿辄’、‘贝达’、‘双红’+‘贝达’、‘维代尔’的可溶性糖含量均在-7℃出现峰值，在0℃～-7℃温度范围内呈上升趋势，-7℃～-15℃呈下降趋势。‘双优’+‘贝达’和‘赤霞珠’的可溶性糖含量峰值出现在-15℃，总体来看，‘贝达’和‘双红’+‘贝达’2个品种可溶性糖含量显著高于其他品种（P<0.05），而‘梅鹿辄’的可溶性糖含量较低。
2.6应用隶属函数法对6种酿酒葡萄抗寒性的综合评价从表2判定6种酿酒葡萄品种的抗寒性大小依次为‘贝达’>‘双优’+‘贝达’>‘双红’+‘贝达’>‘维代尔’>‘赤霞珠’>‘梅鹿辄’。通过本研究可知，电导率和可溶性糖含量与抗寒性关系密切，可以作为6种砧木及酿酒葡萄抗寒性大小的鉴定指标，其他指标与抗寒性关系不密切，不宜直接作为6种砧木及酿酒葡萄抗寒性的鉴定指标。
3讨论
本实验通过对6种酿酒葡萄相对电导率的测定，结果显示，各品种相对电导率随着胁迫温度的逐渐降低而增大，这与王燕凌等[25]和肖用森等[26]研究结果一致。同时大致推测对温度较为敏感的品种，在-7℃左右（电导率超过50%）为其耐性临界值，如酿酒葡萄‘梅鹿辄’在-7℃左右埋土枝条对低温开始了积极响应，而抗寒性强的山葡萄的埋土防寒温度为-17℃左右，因此在嘉峪关市特殊的地理及气候条件下进行大田管理时应予以重视。本研究在人工模拟低温胁迫下得到-7℃为各指标变化的重要拐点，推测在此温度下，葡萄枝条内各指标对低温开始一系列复杂的生理响应，因此还需结合自然降温进一步探讨。
可溶性糖和游离脯氨酸是植物体内的重要渗透调节物质，糖在植物的抗寒生理中，可以提高细胞的渗透浓度，降低水势，增加植株的保水能力，从而使冰点下降，可以缓和细胞质过度脱水，保持细胞不致遇冷凝固，从而提高植物抗寒性[4]。本研究结果说明葡萄枝条在受到低温胁迫时，能够产生较多的糖来保护机体，起到调节机体的作用，‘贝达’和‘双红’+‘贝达’最高，抗寒性较强，‘梅鹿辄’可溶性糖含量最低，抗寒性最弱，其他品种居中。可溶性糖含量与抗寒性关系密切，可以作为6种砧木及酿酒葡萄抗寒性鉴定的生理指标，这与牛锦凤等[1]对鲜食葡萄抗寒性的研究结果一致。低温环境使植物体内积累脯氨酸，多项研究表明，脯氨酸含量越高，植物的抗寒性越强[27]。在本研究中，脯氨酸含量随着处理温度的逐渐降低呈现了持续升高的特征，但是脯氨酸含量与抗寒性之间不存在相关关系，Sanchez等[28]研究认为，植物体内脯氨酸在胁迫响应中的角色尚不明确，一般认为是作为渗透活性物质发挥保护作用，其渗透调节在豆类植物中作用甚微。因此能否依照脯氨酸大小作为抗寒性的评判指标还有待进一步探讨，用综合评判法进行相互印证非常重要，这也与司剑华等[29]研究结果一致。MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，具有很强的细胞毒性，也是衡量膜系统受害的重要指标之一[11]。经过低温处理后，MDA的含量通常增加，本实验结果显示随着胁迫温度的增加，MDA含量均呈逐步上升的趋势，这也与牛锦凤等[1]研究结果一致。
SOD、CAT和POD保护酶的活性也与抗寒性有着密切的关系。在本试验中，6种砧木及酿酒葡萄枝条POD含量随着胁迫温度的降低而呈现逐步降低的趋势，但SOD和CAT含量均为先升高后降低，这可能是植物细胞对低温胁迫的一种保护性应急反应，故通过低温锻炼的诱导可使葡萄细胞内防御活性氧的酶促保护系统能力增强，从而维持了细胞膜的稳定性，提高了葡萄的耐寒性，但随着胁迫温度的进一步降低，超出了品种的耐受范围使细胞膜受损而呈现逐渐降低的趋势。
木本植物的抗寒性是由许多数量或质量遗传基因综合作用累加的结果，每一个与抗寒性有关的性状对木本植物的抗寒性都起一定的作用，但这种作用是微效的[30]。因此要判断酿酒葡萄的抗寒性，需要对各抗寒性生理指标进行综合判断，而单一的某一1044个指标具有片面性，通过对各生理指标进行数量化分析，得到综合指标的平均隶属度。本实验对6种砧木及酿酒葡萄的7项抗寒性生理指标进行隶属函数法综合分析，得出抗寒性大小的次序依次为‘贝达’>‘双优’+‘贝达’>‘双红’+‘贝达’>‘维代尔’>‘赤霞珠’>‘梅鹿辄’，同时通过对各项指标的测定结果分析来看，以上葡萄品种有些是对低温的滞缓响应型品种，如在-15℃左右时才达到指标峰值，有些是快速低温响应型品种，如在-7℃左右时已达到指标峰值。因此对于园艺工作者来讲，掌握各葡萄品种的冬季抗寒能力强弱，并了解其对冬季低温响应的进程，有针对性的加强冬季的防寒管理，对酿酒葡萄在嘉峪关市的引种与栽培管理工作有实际指导意义。#p#分页标题#e#
